包久兵，史良會

（1.皖南醫(yī)學院研究生院，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院胃腸外科）

結(jié)直腸癌（CRC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤導致的死亡中居第5位［1］，預(yù)計到2030年，全球CRC的發(fā)病率將增加60%［2］。對CRC侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機制及腫瘤細胞與外界信息交流的機制的了解，將有助于進一步預(yù)防和治療CRC，其中外泌體介導的運輸形式發(fā)揮著重要作用。癌細胞能釋放多種囊泡，這些囊泡可以通過體液，如外周血、唾液、尿液和腹水等進行轉(zhuǎn)移［3］，某些特殊的細胞囊泡稱為“外泌體（exosomes）”，其與癌癥的進展相關(guān)［4］。

1 外泌體

1.1 外泌體的產(chǎn)生 外泌體是在內(nèi)化過程中由質(zhì)膜產(chǎn)生的。首先，細胞通過內(nèi)吞作用形成早期內(nèi)涵體（early endosomes，EE），其逐漸變?yōu)橥砥趦?nèi)涵體或多泡體（MVBs），MVBs膜內(nèi)陷形成腔內(nèi)囊泡（ILVs），MVBs與溶酶體膜融合可降解蛋白質(zhì)，并且釋放ILVs進入溶酶體，或者MVBs與質(zhì)膜融合，ILVs被釋放到細胞外環(huán)境中，稱為外泌體［5］。外泌體融合了mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)和部分特定區(qū)域的DNA等。外泌體的大小在30～100 nm［6］，40～100 nm［7］，50～150 nm［8］不等。然而，外泌體的生物起源機制尚不十分清楚，還需要進行更深入的研究。

1.2 外泌體的分離方法 根據(jù)其大小、密度、含量、標記物或電位等一些自身特點，從血漿、血清、培養(yǎng)基中分離外泌體的方法有多種。第一種分離方法是超速離心法，因其性能高、操作簡單和易獲得性而被廣泛應(yīng)用［9］。為了從細胞培養(yǎng)物中分離外泌體，必須使用無血清培養(yǎng)基或補充除外泌體的血清培養(yǎng)基來避免可能對結(jié)果造成干擾。超速離心法實施方案：先將上清液以480×g離心5 min，然后再用2 000×g離心10 min，移除細胞和細胞碎片［8，10］；取離心后的上清液，用0.2 μm孔過濾除去大的囊泡，在4℃以100 000×g離心60 min；將沉淀重懸于PBS中，通過蔗糖梯度離心法，在4℃以100 000×g離心60 min進行純化，所得含有外泌體的物質(zhì)必須用PBS洗滌并儲存在-80 ℃環(huán)境中［11］。

近年來，超速離心的替代方法（包括超濾［12］）與日俱增。BiooScientific研發(fā)了“ExoMir Kit”試劑盒，通過第一個微濾器（0.22 μm）移除細胞和細胞碎片等，通過第二個微濾器（0.02 μm），使用正壓驅(qū)動流動并最終獲取外泌體［13］。另外一種方法是：通過使用針對膜蛋白如CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、膜聯(lián)蛋白、EpCAM和Rab5的抗體來特異性分離外泌體，這些抗體被固定在層析基質(zhì)或平板上［14］。值得強調(diào)的是，對于外體的分離、純化、量化或儲存，并沒有一種普遍的方法。我們期待在不久的將來研究出一種普遍適用的方法，這將促進腫瘤的進一步研究。外泌體分離出來后，可以通過不同的技術(shù)如ELISA、Western blot、流式細胞術(shù)，qPCR、蛋白質(zhì)組學或NanoSight等，分析其組成或定量。

2 CRC來源外泌體

外泌體可以攜帶致癌蛋白、腫瘤抑制因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、剪接因子等多種蛋白質(zhì)和RNA（mRNA、miRNA和其他非編碼RNA）［8］。外泌體內(nèi)還包含某些DNA片段，這可能提供有關(guān)癌細胞起源的相關(guān)信息［15-16］。此外，外泌體還可以運輸和遞送大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，并且可以修飾細胞和器官功能［4］。

目前常用下列細胞系來研究CRC，如LIM1215、LIM1863、HCT-15、SW480、SW620、DiFi和WiDr等。這些細胞系的囊泡含有高濃度的細胞黏附蛋白以及參與分子運輸?shù)牡鞍缀桶饣|(zhì)蛋白。Ji等［8］通過免疫親和力的方法，在LIM1863細胞系中發(fā)現(xiàn)了2種外泌體（E-A33和E-EpCAM），其miRNA種類具有顯著差異，E-A33特異性富集了33種miRNAs，其中14種miRNAs在CRC組織分析中未曾報道過，其可能作為診斷CRC的潛在生物標記物。Mitsuru等［7］檢測了CRC細胞系HCT-15、SW480和WiDr分泌的外泌體內(nèi)的RNA種類，發(fā)現(xiàn)了管家基因ACTB mRNA和GAPDH mRNA，miR-21、miR-192、miR-221，以及LRRC24、MDM2和CDKN1A基因的天然反義RNA，這也是首次發(fā)現(xiàn)在外泌體內(nèi)存在天然反義RNA；此外，還發(fā)現(xiàn)來源于CRC細胞系的PKH67標記的外來體被攝取到HepG2和A549細胞中；這些發(fā)現(xiàn)表明，細胞內(nèi)RNA通過外泌體分泌到細胞外，并且源自CRC細胞系的外泌體能夠轉(zhuǎn)移至HepG2和A549細胞中，外泌體中的RNA在細胞間穿梭，可能參與調(diào)節(jié)受體細胞中的基因表達。

Ji等［10］分析比較了來自 SW480細胞系（ESW480）和其轉(zhuǎn)移性SW620細胞系（E-SW620）的“外泌體”中的蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)兩者均含有典型的外泌體標記物TSG101、Alix、CD63；而轉(zhuǎn)移因子（MET、S100A8、S100A9、TNC）、信號轉(zhuǎn)導分子（EFNB2、JAG1、SRC、TNIK）和脂質(zhì)筏及其相關(guān)成分（CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1）選擇性富集于E-SW620中；此外，在E-SW620中也發(fā)現(xiàn)了高水平的Src家族激酶，其與E-SW620中脂筏及其相關(guān)分子CAV1、FLOT1和FLOT2相互作用，參與了信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)吞和細胞骨架重塑，提示它們在信號轉(zhuǎn)導中起重要作用，可促進細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤進展。據(jù)報道，包裹在E-SW620中的七次跨膜磷酸化酪氨酸激酶可能參與調(diào)節(jié)外泌體的生命周期［17］。

KRAS基因在30%～40%的CRC腫瘤中出現(xiàn)了突變，Demory Beckler等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與表達野生型KRAS的CRC細胞分泌的外泌體相比，表達突變型KRAS的細胞分泌的外泌體可增強受體細胞的侵襲性，進一步研究發(fā)現(xiàn)，KRAS突變可顯著影響外泌體的蛋白質(zhì)組成，突變型KRAS的細胞產(chǎn)生的外泌體含有多種促腫瘤蛋白，包括Src家族激酶、EGFR、整合蛋白和突變KRAS蛋白；含突變型KRAS的外泌體可被內(nèi)化并將突變型KRAS轉(zhuǎn)移至含野生型KRAS蛋白的DKs-8細胞中，從而促進DKs-8細胞的黏附和增殖。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-100在含突變型KRAS蛋白的外泌體中顯著增加［18］。

Lydic等［19］比較分析了CRC細胞系LIM1215和其分泌的外泌體的脂質(zhì)譜，結(jié)果顯示在外泌體中存在某些脂質(zhì)的富集，包括鞘脂、固醇脂質(zhì)、甘油脂、甘油磷脂、縮醛磷脂等。

3 外泌體在CRC細胞中的作用

3.1 參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化和增殖 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機制是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。EMT機制與癌癥的發(fā)生、癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的早期階段有關(guān)［20］。研究表明，腫瘤來源的外泌體可以促進受體細胞的EMT過程［21］。Bigagli等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CRC細胞系HCT-8在培養(yǎng)7 d后，一些細胞開始在懸浮液中生長，細胞呈E-鈣黏蛋白陰性和波形蛋白陽性，表明細胞具有失巢凋亡抵抗和轉(zhuǎn)移潛能；通過電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，由貼壁細胞分泌的外泌體可被轉(zhuǎn)移性細胞吸收，并且貼壁細胞分泌的外泌體中的miR-210水平顯著高于細胞內(nèi)水平，因此miR-210可能是EMT的觸發(fā)信號，促進癌細胞轉(zhuǎn)移。

除了影響EMT過程外，從SW620和SW480細胞系中提取的外泌體能夠顯著增加2F2B小鼠內(nèi)皮細胞的體外增殖，從而促進腫瘤血管的生長［10］。這種對內(nèi)皮細胞的影響可能與外泌體中富集細胞周期相關(guān)基因mRNA有關(guān)，這些富集的mRNA主要與細胞周期M期活性相關(guān)，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［23］。CRC來源外泌體能夠誘導結(jié)腸間充質(zhì)干細胞（MSCs）的形態(tài)和功能改變，誘導后的MSCs具有非典型的形態(tài)并且具有更高的增殖率、遷移率和侵襲性［24］。Mulvey等［25］研究發(fā)現(xiàn)，用來自CRC細胞系HCT116和惡性CRC患者組織的外泌體誘導正常結(jié)腸成纖維細胞時，可誘導其產(chǎn)生惡性表型，同樣地，用來自正常結(jié)腸成纖維細胞和正常患者組織的外泌體誘導，逆轉(zhuǎn)了HCT116細胞的惡性表型。還有研究發(fā)現(xiàn)，來自小鼠CRC細胞系CT26的外泌體顯著促進了腫瘤的生長，并降低了動物的存活率；此外，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠?qū)⒕奘杉毎腗1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，并與腫瘤細胞的細胞因子和趨化因子相互作用，從而促進腫瘤的生長［26］。

3.2 參與腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移 Wang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，源自高度肝轉(zhuǎn)移性CRC細胞系HT-29的外泌體可通過招募表達趨化因子受體4（CXCR4）的基質(zhì)細胞來促成轉(zhuǎn)移性微環(huán)境，進而促進CRC的肝轉(zhuǎn)移。Senfter等［28］研究發(fā)現(xiàn)，CRC細胞系CCL227分泌的外泌體含有miR-200家族成員，可轉(zhuǎn)移至鄰近的淋巴內(nèi)皮細胞中，抑制調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和SLUG的表達，外泌體中miR-200c的缺失可能導致鄰近內(nèi)皮細胞產(chǎn)生侵襲、遷移能力。此外，缺氧狀態(tài)下的CRC細胞釋放的外泌體能夠通過富集Wnt4來增加內(nèi)皮細胞中的β-連環(huán)蛋白核轉(zhuǎn)運來促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，在動物體內(nèi)研究也證實CRC細胞分泌的外泌體能促進腫瘤生長以及加快血管生成［29］。由CRC細胞Caco-2分泌的外泌體含有Wnt5b蛋白，能夠刺激A549細胞中的Wnt5b信號傳導，促進A549細胞的遷移和增殖［30］。在CRC患者中，APC（腺瘤性結(jié)腸息肉病）腫瘤抑制基因的突變很常見，并且與Wnt信號傳導失調(diào)有關(guān)，當SW480中穩(wěn)定表達野生型APC時，細胞表現(xiàn)出減弱的Wnt信號傳導，并降低致瘤性；蛋白質(zhì)組分析表明SW480 APC細胞分泌的外泌體特異性表達Wnt拮抗劑DKK4，這可能是調(diào)控Wnt信號通路在CRC發(fā)展過程中丟失的機制［31］。

值得注意的是，不管是在體外或體內(nèi)的研究已經(jīng)表明，CRC細胞的外泌體能通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體（TRAIL）和Fas配體（FasL）誘導T細胞凋亡，這有助于腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的“監(jiān)視”［32］。

4 小結(jié)與展望

癌細胞分泌的外泌體可被靶細胞攝取，在細胞間信號傳導中發(fā)揮重要作用，促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。作為細胞間通訊載體的外泌體可作為CRC診斷和預(yù)后的有效生物標志物。從非侵入性液體活組織中分離的CRC外泌體的核酸和其他成分可以作為CRC早期診斷和預(yù)后監(jiān)測的有效指標。CRC來源外泌體也具有潛在的臨床實用性，其可作為攜帶RNA、蛋白質(zhì)和藥物并作用于靶細胞的載體。外泌體分泌后可以將其攜帶的內(nèi)容物傳遞至相鄰或遠處的細胞，并且可以調(diào)節(jié)受體細胞中的基因表達、信號傳導或整體功能。抑制腫瘤外泌體的的釋放，可作為干擾腫瘤的生物學進展以及減少耐藥性產(chǎn)生的一種治療癌癥方法。在大多數(shù)的研究中，外泌體是從體外培養(yǎng)物中提取的，并且使用的濃度與生理條件有所差別。體外模型提供了有效的工具來實現(xiàn)快速和有價值的實驗結(jié)果。然而，為了加深對CRC來源外泌體的認識及其臨床意義，需要更多的體內(nèi)研究來評估CRC來源外泌體在腫瘤增殖、宿主免疫調(diào)控、血管生成和對治療的反應(yīng)以及其他方面的作用。