華海應(yīng)，高華強，朱文艷，周曄，王志清，張艷，何廣勝

(1南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院，江蘇無錫214041；2江蘇省人民醫(yī)院)

再生障礙性貧血(AA)是一種骨髓造血功能衰竭性疾病，是由功能亢進的T淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]。采取免疫抑制治療可以抑制T淋巴細胞，減少造血負性調(diào)控因子，抵抗自身免疫反應(yīng)，從而促進造血功能重建[2]。但有部分患者對免疫抑制治療無反應(yīng)，被稱為難治性AA；而在免疫抑制治療有效的患者中，仍有約30%的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)。對于難治/復(fù)發(fā)性AA，除異基因造血干細胞移植外，目前尚無統(tǒng)一有效的治療方案。而實際上僅30%的AA患者可以找到HLA相合的供體，再考慮到年齡因素，適合造血干細胞移植的患者并不多，這就需要探索新的治療方法。采用體外半固體瓊脂培養(yǎng)骨髓單個核細胞，計數(shù)骨髓集落形成數(shù)量，可反映AA患者造血祖細胞情況。絕大多數(shù)AA患者各系祖細胞均缺乏，造血祖細胞集落形成少[3]。AA屬中醫(yī)“虛勞”“亡血”“血虛”等范疇。中醫(yī)學(xué)認為，血液的生成、運行和功能狀態(tài)與心、脾、肝、腎有關(guān)，其中與脾、腎的關(guān)系尤為密切[4]。采用補腎健脾化瘀法治療AA已成為目前中醫(yī)藥在這一領(lǐng)域的主流認識。我們在中西醫(yī)結(jié)合治療難治/復(fù)發(fā)AA方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，應(yīng)用補腎健脾化瘀中藥，以當歸、淫羊藿、巴戟天、黃芪、菟絲子、人參、黃精及三七等藥物為基礎(chǔ)方，再根據(jù)辨證情況酌情加減，取得較好的臨床效果。本研究采用補腎健脾化瘀中藥提取物在體外干預(yù)難治/復(fù)發(fā)AA患者骨髓單個核細胞，觀察集落形成情況，探討補腎健脾化瘀中藥對難治/復(fù)發(fā)AA患者骨髓單個核細胞集落形成能力的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2015年8月～2017年7月收治的難治/復(fù)發(fā)AA患者15例，男9例、女7例，年齡11～61歲、中位年齡24歲。納入標準：明確診斷為AA，經(jīng)免疫抑制劑(環(huán)孢素A或聯(lián)合抗胸腺細胞球蛋白)正規(guī)治療6個月無反應(yīng)者為難治性AA；經(jīng)正規(guī)免疫抑制劑治療獲得緩解后，在環(huán)孢素A維持治療過程中出現(xiàn)任何一系列的外周血細胞計數(shù)下降到緩解中位水平的50%以下或需要血制品(紅細胞或血小板)輸注，為復(fù)發(fā)AA。排除標準：存在心、肝、肺、腎功能不全；合并其他嚴重并發(fā)癥；合并惡性腫瘤；全身情況差，不能耐受骨髓穿刺者；對研究藥物過敏者。本研究經(jīng)南通大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.1．1 骨髓單個核細胞的提取 無菌條件下采集患者骨髓液5 mL，注入含肝素抗凝無菌試管中搖勻，用RPMI1640液按1∶1稀釋，然后按1∶1注入淋巴細胞分離液，1 500 r/min離心20 min，用吸管吸取界面處單個核細胞層，RPMI1640洗滌，離心，計數(shù)單個核細胞。用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，回收單個核細胞備用。

1.1.2 中藥試劑購置 黃芪多糖、淫羊藿苷、三七總皂苷、人參二醇由南京景竹生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量分數(shù)分別為：70%、≥85%、90%、95%；巴戟天多糖、菟絲子黃酮、黃精多糖、當歸多糖由陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司提供，質(zhì)量分數(shù)分別為≥95%、90%、85%、90%。

1.2 細胞分組與處理 將骨髓單個核細胞分為中藥組、雷帕霉素組、空白對照組。雷帕霉素組加入終濃度25 nmol/L的雷帕霉素；中藥組加入當歸多糖、淫羊藿苷、巴戟天多糖、黃芪多糖、三七總皂苷、黃精多糖各100 μg/mL，菟絲子黃酮、人參二醇各50 μg/mL；空白對照組加入生理鹽水。每孔1 mL，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 紅系祖細胞紅系集落形成單位(CFU-E)、爆式紅系集落形成單位(BFU-E)檢測 將骨髓單個核細胞懸浮于IMDM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)體系為：40%胎牛血清，0.9%的甲基纖維素，10-5mol/L 2-巰基乙醇，2 U/mL重組人紅細胞生成素，1×105U/L鏈-青霉素，0.3%瓊脂，2×105個單個核細胞。按1.3方法進行分組處理，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，10 d后計數(shù)CFU-E集落(≥8個細胞)、BFU-E集落(≥50個細胞)。

1.4 粒細胞巨噬細胞集落生成單位(CFU-GM)檢測 將骨髓單個核細胞懸浮于IMDM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)體系為：40%胎牛血清，0.9%的甲基纖維素，1×105U/L鏈-青霉素，0.3%瓊脂，20 mg/L rhGM-CSF，2×105個單個核細胞。按1.3方法進行分組處理，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，10 d后計數(shù)CFU-GM集落(≥50個細胞)。

2 結(jié)果

2.1 三組CFU-E集落數(shù)比較 中藥組、雷帕霉素組、空白對照組的CFU-E集落數(shù)分別為(20.02±1.46)、(22.88±1.38)、(3.18±0.23)個，雷帕霉素組、中藥組均較空白對照組增加(P均<0.01)，雷帕霉素組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 三組BFU-E集落數(shù)比較 中藥組、雷帕霉素組、空白對照組的BFU-E集落數(shù)分別為(5.56±1.25)、(6.25±1.14)、(2.51±0.74)個，雷帕霉素組、中藥組均較空白對照組增加(P均<0.01)，雷帕霉素組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 三組CFU-GM集落數(shù)比較 中藥組、雷帕霉素組、空白對照組的CFU-GM集落數(shù)分別為(13.22±1.65)、(15.46±2.82)、(4.47±1.13)個，雷帕霉素組、中藥組均較空白對照組增加(P均<0.01)，雷帕霉素組與中藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

目前AA的治療常采用環(huán)孢素A、抗淋巴細胞球蛋白或抗胸腺細胞球蛋白抑制T淋巴細胞，大部分患者病情好轉(zhuǎn)，但仍有部分患者治療無效或緩解后復(fù)發(fā)，原因主要為環(huán)孢素A不能抑制T淋巴細胞而發(fā)生耐藥。目前認為，T淋巴細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為兩種：由T細胞受體(TCR)/CD3、佛波醇酯類及伊諾霉素介導(dǎo)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由白細胞介素-12(IL-12)或聯(lián)合IL-18或CD28介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。前者對環(huán)孢素A敏感，后者對環(huán)孢素A耐藥[5]。對于難治/復(fù)發(fā)性AA，除異基因造血干細胞移植外，目前尚無統(tǒng)一有效的治療方案。雷帕霉素是一種強有效的新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，用于器官移植的抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的治療，其用于AA免疫治療時比環(huán)孢素的抑制免疫能力強數(shù)十倍，與環(huán)孢素有良好的協(xié)同作用，且能克服環(huán)孢素耐藥途徑[6]。西醫(yī)治療AA采用雄性激素及免疫抑制劑，部分患者難以耐受長期服藥帶來的不良反應(yīng)，少數(shù)患者可出現(xiàn)嚴重肝腎損害，且長期服藥費用昂貴。中醫(yī)學(xué)的基本特點是整體觀念和辨證施治，強調(diào)對疾病必須有理、法、方、藥的系統(tǒng)認識和合理的調(diào)治。治病急則治其標，緩則治其本，在AA的治療中有其獨特優(yōu)勢。

中醫(yī)學(xué)認為，血液的生成、運行和功能狀態(tài)與心、脾、肝、腎四臟有關(guān)，其中與脾、腎的關(guān)系尤為密切[7]。既往研究認為，AA的辨證傾向于脾虛，但補脾益氣治療效果并不理想。因此我們從腎虛入手，以腎為根本，探討補腎中藥治療AA的可行性。腎主骨生髓，腎藏精，精血互化，腎精虧虛，骨髓失于充養(yǎng)，不能化生氣血，以致唇甲淡白、面色萎黃、乏力、氣短、心悸，腦失滋養(yǎng)，導(dǎo)致頭暈、耳鳴、健忘；骨髓空虛，腰府失養(yǎng)，致使氣虛無力推動血脈運行，腰膝酸軟；血虛則血行不暢，導(dǎo)致離經(jīng)之血不去；瘀阻絡(luò)脈，致使皮膚瘀點或瘀斑；瘀血不去，新血不能生，致病情纏綿難愈。因此氣血不足、腎精虧虛、瘀血內(nèi)阻是AA的重要病機，治療宜采用補腎為主的中藥。研究顯示，補腎陰、補腎陽、健脾化瘀中藥治療AA已取得一定療效[8]。臨床用于治療AA的補腎陽藥包括菟絲子、淫羊藿、巴戟天等，現(xiàn)代藥理研究顯示，菟絲子改善腎虛排卵障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)可能基于其主要成分黃酮的作用[9],淫羊藿苷具有雌激素樣、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、壯陽等作用[10],巴戟天多糖亦具有增強機體免疫、改善生殖等作用[11]。用于治療AA的補腎陰藥物有熟地黃、黃精等，熟地黃多糖、黃精多糖均具有調(diào)節(jié)免疫的功能[12]。用于治療AA的益氣養(yǎng)血藥有人參、當歸、黃芪等，人參二醇能有效促進造血，改善AA的骨髓抑制，加快造血功能恢復(fù)，升高外周血象，同時通過恢復(fù)AA小鼠失衡的Th1/Th2/Treg細胞比例而參與調(diào)節(jié)免疫[13]；當歸多糖對造血細胞的增殖、分化有顯著刺激作用[14]；黃芪多糖可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的成熟DC細胞特異性激活T細胞從而啟動細胞免疫[15]，還可以刺激B細胞的活化與增殖來提高機體的體液免疫能力[16]。用于治療AA的活血藥物有三七等，三七總皂苷通過促進骨髓粒系、紅系造血祖細胞的增殖，改善骨髓造血組織增生，從而促進血細胞的生成[17,18]。上述諸藥合用可兼補腎陰、腎陽虛，健脾化瘀。

AA患者骨髓造血能力差，體外培養(yǎng)骨髓單個核細胞可發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力降低，集落形成數(shù)量減少。本研究采用補腎健脾化瘀中藥提取物在體外干預(yù)難治/復(fù)發(fā)AA患者的骨髓單個核細胞，觀察細胞集落形成情況，結(jié)果顯示，雷帕霉素組和中藥組的CFU-E、BFU-E、CFU-GM均較對照組增加。表明補腎健脾化瘀中藥能夠提高難治/復(fù)發(fā)AA患者的骨髓單個核細胞集落形成，從而恢復(fù)骨髓造血功能，與雷帕霉素效果相似。

綜上所述，補腎健脾化瘀中藥提取物對難治/復(fù)發(fā)AA患者骨髓CFU-E、BFU-E、CFU-GM具有明顯的促增殖作用，補腎健脾化瘀中藥提升血細胞的作用可能是通過促進骨髓單個核細胞集落形成、促進骨髓造血祖細胞增殖來實現(xiàn)的。本研究為臨床上使用補腎健脾化瘀中藥治療難治/復(fù)發(fā)AA提供了理論依據(jù)。