湯婷婷，劉華鋼，梁燕，范玉琴，吳余燕

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530299；2廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

目前治療腫瘤的主要方法是化療。超過一半的腫瘤會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)，而腫瘤MDR的出現(xiàn)是致使化療失敗的原因之一。MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物耐藥的同時(shí)，對(duì)非同類型的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生給腫瘤治療帶來巨大挑戰(zhàn)。腫瘤耐藥機(jī)制復(fù)雜，主要包括：p-糖蛋白(p-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)及肺耐藥蛋白(LRP)等高表達(dá)使得細(xì)胞內(nèi)化療藥物外排，藥效作用減輕或消失；lncRNA通過調(diào)控與腫瘤耐藥信號(hào)通路相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)來調(diào)控MDR的產(chǎn)生；MDR相關(guān)酶如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、蛋白酶C(PKC)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)等活性增強(qiáng)或過度表達(dá)；抑制自噬可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞MDR的產(chǎn)生；細(xì)胞凋亡機(jī)制異常；低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)上調(diào)[1～3]。目前關(guān)于腫瘤MDR機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)。MDR體內(nèi)和體外模型的建立為進(jìn)一步闡明MDR的機(jī)制、逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR和提高化療效果奠定了基礎(chǔ)[4，5]。隨著各種MDR模型建立方法的出現(xiàn)，建模方法的優(yōu)劣勢(shì)也在實(shí)踐中充分體現(xiàn)。現(xiàn)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的腫瘤MDR建模方法及其優(yōu)劣勢(shì)綜述如下。

1 腫瘤MDR體外模型建立方法

主要分為高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)法、藥物濃度遞增誘導(dǎo)法、高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)與藥物濃度遞增相結(jié)合法、轉(zhuǎn)基因結(jié)合藥物篩選法和三維細(xì)胞培養(yǎng)法。上述5種建模方法各有優(yōu)劣勢(shì)，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇。

1.1 高濃度間歇誘導(dǎo)法 高濃度間歇誘導(dǎo)法是指選擇使用高劑量的藥物短時(shí)間作用后正常培養(yǎng)恢復(fù)，反復(fù)進(jìn)行直到產(chǎn)生耐藥性[6]。李一春等[7]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3以IC50(10.0 μmol/L)的阿霉素(ADM)孵育2 h后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，舍棄含藥培養(yǎng)液改用普通1640繼續(xù)培養(yǎng)，保留存活細(xì)胞待長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，再按相同的濃度給藥，反復(fù)重復(fù)上述換液、消化、傳代過程，每4周檢測(cè)耐藥性，4個(gè)月后最終獲得能完全耐受10.0 μmol/L ADM的細(xì)胞株OVCAR-3/ADM。張丹等[8]選取終濃度為500 ng/mL的培美曲塞二鈉(PEM)作為干預(yù)濃度作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌細(xì)胞A549，經(jīng)過4個(gè)月反復(fù)沖擊，最終成功建立A549細(xì)胞培美曲塞耐藥株模型，獲得所需要耐藥指數(shù)為27.18±1.16的耐藥細(xì)胞株A549/PEM，誘導(dǎo)成功的A549/PEM較親本株A549形態(tài)不規(guī)則，兩種細(xì)胞株在倍增時(shí)間、生長(zhǎng)曲線方面很相近，且脫藥4周后A549/PEM細(xì)胞仍能穩(wěn)定生長(zhǎng)、傳代。高濃度反復(fù)間歇法雖然誘導(dǎo)所需周期比較長(zhǎng)，但制作過程更近似臨床周期性化療的用藥模式[9]。

1.2 藥物濃度遞增誘導(dǎo)法 該法為從低到高逐漸增加藥物濃度，直到誘導(dǎo)出MDR細(xì)胞系。洪廣亮等[10]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，給予的耐百草枯(PQ)濃度從100 μmol/L開始，加藥24 h后換液去除藥物，待細(xì)胞重新生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后再次加相同濃度PQ刺激，如此重復(fù)3次后，延長(zhǎng)暴露時(shí)間至48 h，重復(fù)上述過程，再依次增加PQ濃度(100、200、400、600、800 μmol/L)，連續(xù)培養(yǎng)11個(gè)月，成功建立A549耐PQ細(xì)胞株(A549/PQ)。張徐寧等[11]采用相似方法成功建立了耐DDP食管癌細(xì)胞系Eca109/DDP，細(xì)胞對(duì)DDP耐藥指數(shù)為15.886。藥物濃度遞增誘導(dǎo)法在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用率較高，建立的腫瘤MDR模型耐藥性相對(duì)穩(wěn)定、可信。且所建耐藥株模型在撤藥或長(zhǎng)時(shí)凍存后依然保持很高的耐藥性，大大提高了誘導(dǎo)成功率[12]，但此法建立耐藥株周期長(zhǎng)，細(xì)胞的耐藥性與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。

1.3 高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)與藥物濃度遞增相結(jié)合法 是將高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)法與藥物濃度遞增法相結(jié)合的誘導(dǎo)方法。高愛麗[13]首先采用逐步加大ADM濃度(0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 3個(gè)月，篩選出存活細(xì)胞，之后在無藥普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周；同時(shí)采用高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)，即給予1 mg/L的ADM培養(yǎng)4代，篩選存活細(xì)胞，之后在無藥普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周；將以上兩種方法獲得的存活細(xì)胞株放在一起共同培養(yǎng)，加入1 mg/L的ADM；最后在無藥普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)4周，整個(gè)過程持續(xù)約5個(gè)月，成功建立了耐ADM乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ADM。趙寶霞[14]采用逐步遞增吉非替尼濃度、間歇作用體外誘導(dǎo)法誘導(dǎo)EGFR基因19外顯子缺失突變的人肺癌細(xì)胞株NCI-H1650產(chǎn)生耐藥，成功建立了耐藥模型EGFR-TKI。高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)與藥物濃度遞增相結(jié)合法穩(wěn)定性好，耐藥倍數(shù)高于兩種方法單獨(dú)運(yùn)用所建的模型，但該法實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，藥物劑量不好把握，且培養(yǎng)周期長(zhǎng)。

1.4 轉(zhuǎn)基因結(jié)合藥物篩選法 該法優(yōu)勢(shì)是建立的耐藥模型所需時(shí)間短、耐藥基因型單純、耐受性強(qiáng)、效率高、穩(wěn)定等，是近年來新興的耐藥細(xì)胞建模方法。榮小麗[15]利用LIMK1基因轉(zhuǎn)染人骨肉瘤耐藥細(xì)胞系MG6/VCR，通過長(zhǎng)春新堿短暫誘導(dǎo)和G418篩選，建立LIMK1基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG6/VCR。

1.5 三維細(xì)胞培養(yǎng)法 三維細(xì)胞培養(yǎng)法是指利用具有三維結(jié)構(gòu)的材料作為載體與腫瘤細(xì)胞在體外一起培養(yǎng)，讓腫瘤細(xì)胞能夠在載體的三維體系中呈三維狀態(tài)生長(zhǎng)、遷移，成為三維細(xì)胞-載體復(fù)合物。三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞耐藥性與在體腫瘤相近且與單層細(xì)胞相比耐藥性明顯增強(qiáng)。姜昊聲等[16]取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基潤(rùn)洗加凝膠微孔支架的3D多細(xì)胞球培養(yǎng)板，加入細(xì)胞懸液培養(yǎng)3 d后加ADM培養(yǎng)液，于加藥培養(yǎng)3 d后計(jì)算細(xì)胞耐藥指數(shù)，結(jié)果顯示三維培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞對(duì)ADM明顯耐藥，說明成功建立了乳腺癌MDR模型。徐紅等[17]首先制備MCF-7細(xì)胞懸液備用，隨后將Ⅰ型鼠尾膠原溶液與PBS、NaOH混合，使Ⅰ型鼠尾膠原的終濃度為2.0 g/L；將備用的MCF-7細(xì)胞調(diào)節(jié)至適宜密度接種至膠原溶液并混合均勻，將其混合液加入孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隨后加藥、觀察、檢測(cè)，結(jié)果顯示三維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)5-氟尿嘧啶、ADM、卡鉑的藥物敏感性顯著降低的現(xiàn)象，細(xì)胞中P-gp、mrp2 mRNA及P-gp蛋白表達(dá)增高，成功構(gòu)建了具有耐藥表型的乳腺癌三維培養(yǎng)模型。三維細(xì)胞培養(yǎng)法建立的MDR模型生物學(xué)活性與在體腫瘤更接近且能模擬其微環(huán)境，能更真實(shí)地模擬藥物與腫瘤的互相作用，但培養(yǎng)系統(tǒng)較復(fù)雜，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)[18]。

2 腫瘤MDR體內(nèi)模型建立方法

國(guó)內(nèi)外對(duì)MDR機(jī)制的認(rèn)識(shí)和逆轉(zhuǎn)劑的研發(fā)除了來自體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究成果，還得益于體內(nèi)模型即動(dòng)物模型的建立。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的是體外誘導(dǎo)的細(xì)胞，而動(dòng)物模型能更好地反映體內(nèi)腫瘤形成的情況。MDR動(dòng)物模型的建立是研究逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的必要基礎(chǔ)。目前，MDR體內(nèi)模型分為移植型和誘導(dǎo)型兩種，最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠和大鼠，近些年斑馬魚因其個(gè)體小、胚胎透明、實(shí)驗(yàn)周期短，基因與人類極其相似也廣泛用于人類疾病模型的建立[19]。胡榮英等[20]利用長(zhǎng)春新堿暴露處理受精后的斑馬魚，結(jié)果顯示長(zhǎng)春新堿能增加班馬魚腫瘤耐藥基因abcb4的表達(dá)，該模型建立提示復(fù)制腫瘤MDR模型可利用斑馬魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1 移植型腫瘤MDR動(dòng)物模型 為直接將耐藥細(xì)胞株或腫瘤組織接種到動(dòng)物體內(nèi)的方法。井歡等[21]在體外培養(yǎng)肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制備成懸浮液，將其注射于健康BALB/c小鼠腋下，5 h后觀察到腋下有米粒突起，建模成功，建立的移植瘤細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥倍數(shù)與原代細(xì)胞相比差別不大，此法建模周期短且成瘤率高。張琦等[22]將人腎癌腫瘤組織塊穿刺接種到小鼠腎實(shí)質(zhì)組織中，建立腎癌原位腫瘤模型，術(shù)后2周B超檢查見腫瘤發(fā)生，HE染色顯示腎癌原位模型腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，膀胱癌模型可見明顯突向膀胱腔的癌組織團(tuán)塊。細(xì)胞株移植建立的MDR動(dòng)物模型具有創(chuàng)傷面積小、易于重復(fù)、操作簡(jiǎn)單易行、腫瘤位于淺表方便觀察、耐藥性較穩(wěn)定、個(gè)體差異較小、實(shí)驗(yàn)周期較短等優(yōu)點(diǎn)；不足是用于移植的耐藥株耐藥指數(shù)越高，在動(dòng)物體內(nèi)的致瘤率越低。腫瘤組織塊移植方法建立的MDR模型彌補(bǔ)了細(xì)胞接種法容易漏失到腹腔的缺點(diǎn)，也不會(huì)因細(xì)胞接種法帶來的后續(xù)問題對(duì)種植腫瘤造成影響，但所耗周期比較長(zhǎng)[23]。

2.2 誘導(dǎo)型腫瘤MDR動(dòng)物模型 這種方法是仿照人體MDR的形成過程來建立MDR動(dòng)物模型。曹淵等[24]首先對(duì)健康裸鼠采用直線加速器3 Gy全身照射及背部皮下注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞K562，成功建立K562細(xì)胞株裸鼠荷瘤模型；然后在已經(jīng)成瘤的裸鼠瘤內(nèi)持續(xù)8周注射低劑量ADM，成功建立耐ADM的裸鼠荷瘤模型。盛秀勝等[25]使用小劑量多柔比星誘導(dǎo)S180荷瘤小鼠，此方法是將含有小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株S180移植到小鼠體內(nèi)，待成功建立小鼠肉瘤模型后，利用小劑量多柔比星誘導(dǎo)法注射誘導(dǎo)劑，反復(fù)給藥，持續(xù)8周，成功建立了耐多柔比星的S180荷瘤小鼠模型。該法克服了一些化療方案所誘導(dǎo)的S180荷瘤小鼠死亡率高的缺點(diǎn)，彌補(bǔ)了由于化療藥物作用影響因素過于復(fù)雜而無法獲取相對(duì)一致的模型的劣勢(shì)。但該法所建立的模型耐藥倍數(shù)不高，所以并不適合建立要求耐藥倍數(shù)高的動(dòng)物模型。

綜上所述，高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)法、藥物濃度遞增誘導(dǎo)法、高濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)與藥物濃度遞增相結(jié)合法、轉(zhuǎn)基因結(jié)合藥物篩選法和三維細(xì)胞培養(yǎng)法這五種腫瘤MDR體外模型建立方法各有優(yōu)劣勢(shì)，其中三維細(xì)胞培養(yǎng)法建立的MDR模型生物學(xué)活性與在體腫瘤更接近且能模擬體內(nèi)微環(huán)境，彌補(bǔ)了其他四種方法的不足，但培養(yǎng)系統(tǒng)較復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。移植型MDR動(dòng)物模型和誘導(dǎo)型MDR動(dòng)物模型作為腫瘤MDR體內(nèi)模型建立方法優(yōu)勢(shì)明顯，均能保持動(dòng)物原有的組織學(xué)構(gòu)造及原腫瘤細(xì)胞的各項(xiàng)特性，重現(xiàn)原始腫瘤結(jié)構(gòu)，能模擬體內(nèi)微環(huán)境，反映體內(nèi)腫瘤形成情況，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有可靠性和說服力。我們還可以在體內(nèi)模型建模時(shí)間、成瘤率及建模動(dòng)物類型方面有所突破，以優(yōu)化腫瘤MDR體內(nèi)模型的構(gòu)建，為深入研究耐藥機(jī)制和耐藥逆轉(zhuǎn)方法奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供參考。

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