辛秉昌，吳洪斌，孫德剛，吳迪，呂健，公文，王芳(青島市口腔醫(yī)院，山東青島266001)

齲病是造成牙髓損傷的主要原因，而造成齲病的主要原因是細(xì)菌入侵。當(dāng)深齲近髓或牙髓感染時(shí)，革蘭陰性菌的重要成分脂多糖(LPS)侵入牙髓組織導(dǎo)致牙髓損傷[1]。同時(shí)，LPS也能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞(DPSC)向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，其可能參與牙髓的修復(fù)[2]。DPSC是牙髓組織中的一類成體干細(xì)胞，具有自我復(fù)制和多向分化的潛能。其依賴于微環(huán)境的調(diào)節(jié)，可分化為成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等[3，4]。與其他組織來源的干細(xì)胞相比，DPSC可取自拔除的牙齒，屬于生物廢棄物，不涉及倫理問題[5]。因此，DPSC已成為干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在DPSC的生物過程中，微小RNA(miRNA)起重要作用[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[8]。而miR-140-5p對(duì)DPSC的作用尚不清楚。2017年3月～2018年1月本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，L-抗壞血酸2-磷酸酯(美國(guó)Invitrogen公司)，L-谷氨酰胺、青霉素及鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)，LPS(美國(guó)Sigma公司)，對(duì)照miRNA、miR-140-5p模擬物和抑制劑hsa-mir-140-5p miRNA inhibitor(中國(guó)GenePharma公司)，Total RNA試劑盒(中國(guó)Tiangen公司)，Prime Script Reverse Transcription System試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，SYBR Green Mix(日本TaKaRa公司)，Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司)，Benchmark微孔板讀數(shù)器、酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司)。

1.2 DPSC提取及培養(yǎng) 收集本院健康志愿者(男女各5名，年齡18～24歲)拔除的完整、無齲損第三磨牙10顆。無菌條件下于牙頸部將牙齒劈斷，拔髓針取出牙髓，參考文獻(xiàn)[9]分離提取DPSC。本研究由青島市口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，志愿者均簽署獲知情同意書。分離的細(xì)胞接種于含15%胎牛血清、100 mmol/L L-抗壞血酸2-磷酸酯、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 LPS干預(yù)后DPSC內(nèi)miR-140-5p表達(dá)檢測(cè) 將細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔板，利用濃度為1 μg/mL的LPS刺激DPSC，分別于第0、1、3、5和7天檢測(cè)DPSC內(nèi)miR-140-5p的表達(dá)。另外，用不同濃度(0.01、0.1、1、10 μg/mL)LPS刺激DPSC，第5天用qPCR技術(shù)檢測(cè)DPSC內(nèi)miR-140-5p的表達(dá)。用Total RNA試劑盒從處理后的細(xì)胞中提取RNA，用Prime Script Reverse Transcription System試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green Mix進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系25 μL(雙蒸水8.5 μL、引物2 μL、模板2 μL、SYBR Green12.5 μL)。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCT法根據(jù)周期閾值(CT)分析數(shù)據(jù)，并歸一化為RNU6基因(U6)。莖環(huán)引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTACCA-3′；正向定量引物： 5′-GGGCAGTGGTTTTACCCTA-3′；反向定量引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

1.4 miR-140-5p轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的DPSC隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-140-5p組、抑制劑組，miRNA寡核苷酸合成對(duì)照miRNA、miR-140-5p模擬物和抑制劑(GenePharma公司)，以10 nmol/L的濃度分別轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞。

1.5 DPSC增殖能力測(cè)定 將轉(zhuǎn)染后的DPSC以1×103/孔接種于96孔微量培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，并用1 μg/mL的LPS進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)第0、1、3、5、7天取各組細(xì)胞，用MTT細(xì)胞增殖試劑盒評(píng)估細(xì)胞增殖情況。用Benchmark微孔板讀數(shù)器測(cè)量酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處的吸光度值，用吸光度值表示細(xì)胞增殖能力。

1.6 DPSC分化能力檢測(cè) 采用堿性磷酸酶(ALP)染色和茜素紅S染色法。轉(zhuǎn)染并經(jīng)1 μg/mL的LPS干預(yù)24 h，取各組細(xì)胞用成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)將牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞[2]。培養(yǎng)7 d，各組分別取部分細(xì)胞用ALP染色試劑盒評(píng)估DPSC體外分化，PBS洗滌細(xì)胞后于25 ℃下用4%多聚甲醛中固定30 min，使用ALP染色試劑盒37 ℃下染色20 min，去離子水洗滌，用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)520 nm處吸光度值。培養(yǎng)14 d，另取部分細(xì)胞行茜素紅S染色，固定的DPSC在室溫下用1%茜素紅S染色30 min，在光學(xué)顯微鏡下成像，用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)562 nm處吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 LPS介導(dǎo)DPSC分化過程中miR-140-5p的表達(dá)變化 濃度為1 μg/mL的LPS干預(yù)DPSC第0、1、3、5、7天miR-140-5p相對(duì)表達(dá)量分別為5.08±0.40、3.46±0.33、2.44±0.29、1.60±0.34、1.27±0.30，隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)DPSC為miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)。分別用濃度0.01、0.1、1、10 μg/mL的LPS干預(yù)DPSC 5 d后miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量分別為3.48±0.36、2.27±0.35、1.58±0.30、1.36±0.29，隨LPS濃度升高DPSC為miR-140-5p的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)。

2.2 miR-140-5p對(duì)DPSC增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染后干預(yù)第0、1、3、5、7天，對(duì)照組吸光度值分別為0.23±0.05、0.28±0.08、0.33±0.07、0.65±0.06、0.77±0.06，miR-140-5p組分別為0.26±0.06、0.30±0.10、0.38±0.08、0.85±0.07、1.24±0.04，抑制劑組分別為0.22±0.05、0.27±0.07、0.30±0.05、0.45±0.02、0.61±0.05。干預(yù)第5、7天，miR-140-5p組增殖能力較對(duì)照組、抑制劑組高(P均<0.05)，抑制劑組較對(duì)照組低(P均<0.05)

2.3 miR-140-5p對(duì)DPSC分化能力的影響 對(duì)照組ALP和茜素紅S染色后的吸光值分別為0.54±0.09、0.51±0.09，miR-140-5p組分別為0.32±0.06、0.34±0.07，抑制劑組分別為0.98±0.10、0.84±0.12。miR-140-5p組分化能力較對(duì)照組、抑制劑組低(P均<0.05)。

3 討論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分的一種，是齲病和牙髓病的重要致病因子[10]。LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子可在牙髓組織中的成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和干細(xì)胞引發(fā)多種免疫應(yīng)答。當(dāng)深齲近髓或牙髓感染時(shí)，LPS侵入牙髓組織使DPSC黏附和遷移能力增強(qiáng)[11]。另外，LPS能夠促進(jìn)DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并具有顯著的時(shí)間依賴性和濃度依賴性[2]。越來越多的研究證實(shí)，DPSC具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能，在修復(fù)組織損傷方面具有潛在的治療價(jià)值[12]。因此，深入認(rèn)識(shí)DPSC增殖和分化的過程及其調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)探索治療齲病和牙髓病的新方法，在干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用都具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在DPSC的增殖和分化過程中發(fā)揮了重要作用。

miRNA是一類長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過特異性識(shí)別靶基因的3′非翻譯區(qū)并與之結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[13]。miRNA是多種生物過程的重要調(diào)控因子，如細(xì)胞凋亡、增殖、干細(xì)胞功能及細(xì)胞重編程等[14,15]。不同類型miRNA的差異表達(dá)可能與DPSC表型、增殖和分化的調(diào)控有關(guān)[7]。Barter等[8]利用miRNA微陣列芯片分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-140-5p通過調(diào)控多種因子參與軟骨形成，從而推斷miR-140-5p是一種參與骨形成的特異性miRNA。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p可通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化和成骨分化。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)miR-140-5p對(duì)DPSC的調(diào)控作用，本研究檢測(cè)了LPS介導(dǎo)的DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程中miR-140-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-140-5p的表達(dá)隨干預(yù)時(shí)間的增加而逐漸降低，具有時(shí)間依賴性；其表達(dá)水平也隨LPS濃度的增高而降低，具有濃度依賴性?？梢姡琺iR-140-5p與LPS介導(dǎo)的DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過程密切相關(guān)。

成牙本質(zhì)細(xì)胞的主要功能是形成牙本質(zhì)，ALP在硬組織形成中可促進(jìn)鈣化，是參與骨等礦化組織代謝和再生的重要物質(zhì)。在成牙本質(zhì)細(xì)胞中ALP水平較高，ALP是DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的指標(biāo)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p過表達(dá)時(shí)ALP水平降低，而抑制miR-140-5p表達(dá)時(shí)ALP水平升高，提示miR-140-5p能夠抑制DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。DPSC在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化時(shí)，可形成礦化結(jié)節(jié)，這種礦化結(jié)節(jié)主要為牙本質(zhì)樣的礦化基質(zhì)。因此，礦化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)可作為DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志，茜素紅染色能夠顯示出礦化結(jié)節(jié)的量[17]。本研究用茜素紅染色，結(jié)果表明，miR-140-5p能夠抑制DPSC的體外礦化能力，提示miR-140-5p抑制DPSC分化?？傊甿iR-140-5p的過表達(dá)能夠促進(jìn)DPSC增殖并抑制DPSC向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，而抑制miR-140-5p表達(dá)時(shí)則產(chǎn)生相反的作用。本研究結(jié)果支持Zhang等[16]關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究，表明miR-140-5p對(duì)不同種類干細(xì)胞的調(diào)控作用具有一致性，是干細(xì)胞分化過程中的重要調(diào)控因子。

綜上所述，miR-140-5p是一種可用來調(diào)控DPSC增殖和分化的miRNA。這一發(fā)現(xiàn)在牙髓組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。miR-140-5p具有維持干細(xì)胞表型和調(diào)控礦化組織形成的潛在用途，可為牙髓疾病和退行性骨病的治療提供新思路。

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