解廣東，王本軍，韓瑋瑋，白克運(yùn)

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率、病死率分別高居惡性腫瘤第3位和第5位，嚴(yán)重威脅著國(guó)民的健康[1]。目前，結(jié)直腸癌的治療以外科手術(shù)為主，并采用化療、放療、靶向治療等多學(xué)科的綜合治療，其術(shù)后5年生存率不斷提高，但仍有較多患者術(shù)后因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡。一項(xiàng)包含18個(gè)臨床試驗(yàn)的薈萃分析表明，結(jié)直腸癌患者術(shù)后8年隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)35%[2]，而Ⅰ～Ⅲ期患者結(jié)直腸癌根治術(shù)后因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移死亡者占5%～35%[3]。其中，結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起到了重要作用。因此，研究結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，降低結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率成為亟待解決的問(wèn)題。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是由機(jī)體多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生并可介導(dǎo)其抑制效應(yīng)的一種細(xì)胞負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子，可抑制免疫T細(xì)胞的增殖及分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞表型，抑制T細(xì)胞活性及其他因子產(chǎn)生，導(dǎo)致免疫功能低下，廣泛參與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展[4]。目前，對(duì)TGF-β1在結(jié)直腸腫瘤術(shù)后免疫逃逸中的作用機(jī)制認(rèn)識(shí)尚不深入，與結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相互關(guān)系研究尚不足。本研究通過(guò)檢測(cè)并對(duì)比結(jié)直腸癌與癌旁組織、術(shù)后復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者TGF-β1表達(dá)情況，分析復(fù)發(fā)患者TGF-β1表達(dá)水平與無(wú)瘤生存期的關(guān)系，探究TGF-β1與免疫逃逸的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年2月～2014年8月于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科住院并行手術(shù)治療的符合下述納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除的組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整，年齡18～80歲；②病理明確診斷為原發(fā)性結(jié)腸癌或直腸癌；③術(shù)前未接受放療、化療等其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有廣泛腫瘤轉(zhuǎn)移；②合并消化道梗阻、出血或穿孔等急癥手術(shù)者；③合并肝、腎、造血系統(tǒng)、心腦血管疾病等。本研究共納入符合要求的患者139例，根據(jù)隨訪期內(nèi)有無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移將患者分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。其中復(fù)發(fā)組47例，男28例、女19例，年齡(53.7±17.3)歲，TNM分期Ⅱ期21例、Ⅲ期26例；未復(fù)發(fā)組92例，男57例、女35例，年齡(55.2±14.5)歲，TNM分期Ⅱ期42例、Ⅲ期50例。兩組性別、年齡及TNM分期等方面均無(wú)顯著差異；同時(shí)術(shù)中留取60例患者癌組織邊緣5 cm之外的癌旁正常組織。本研究已獲山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者本人或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 TGF-β1檢測(cè)方法 采用免疫組化法。將所有切除后新鮮標(biāo)本固定在10%甲醛固定液中，取出標(biāo)本，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后，切片，片厚4 μm，烤干后保存?zhèn)溆茫粶y(cè)定時(shí)進(jìn)行二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，3%過(guò)氧化氫-甲醇溶液浸泡滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)下微波修復(fù)抗原；以正常山羊血清封閉非特異性抗原后,滴加兔抗人TGF-β1單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，工作液濃度為1∶500)、生物素化二抗；各步驟間均以0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，嚴(yán)格按照說(shuō)明控制時(shí)間和溫度；DAB 顯色、蘇木精輕微襯染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的染色情況。 TGF-β1陽(yáng)性物質(zhì)均定位在腫瘤細(xì)胞以及間質(zhì)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。采用HIPAS100圖像分析軟件對(duì)所有切片進(jìn)行圖像分析，先于低倍鏡尋找每張切片著色的典型區(qū)域，根據(jù)不同的染色強(qiáng)度可觀察到無(wú)色、黃色、棕黃色、棕褐色等色差，代表TGF-β1的不同表達(dá)強(qiáng)度；在每張切片典型區(qū)域內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)的視野，放大400倍鏡下測(cè)量每個(gè)視野下的陽(yáng)性灰度單位，取其均數(shù)即為TGF-β1表達(dá)水平。

1.3 腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移觀察方法 患者均于術(shù)后開(kāi)始隨訪，定期復(fù)查。如臨床懷疑腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，復(fù)查血清腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA199等)，并行結(jié)腸鏡檢查、胸腹盆腔CT掃描，必要時(shí)可行PET-CT檢查來(lái)判定結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，記錄復(fù)發(fā)患者的無(wú)瘤生存時(shí)間；隨訪終點(diǎn)為確認(rèn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或患者死亡或隨訪期滿3年[5]。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1在結(jié)直腸癌與癌旁組織中的表達(dá)情況 TGF-β1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量為22.53±5.98，高于癌旁組織中的14.58±3.19 (P<0.05)。

2.2 TGF-β1在復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況 復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌組織中TGF-β1表達(dá)量為26.19±6.05，高于未復(fù)發(fā)組的20.80±5.03(P<0.05)。

2.3 TGF-β1表達(dá)水平與無(wú)瘤生存期的關(guān)系 47例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，其無(wú)瘤生存期為(21.36±7.12)個(gè)月；經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，TGF-β1表達(dá)水平與無(wú)瘤生存期呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.419，P<0.05)。

3 討論

腫瘤的免疫逃逸是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)被抑制在逃逸過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，為腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了必備的條件，成為不可忽視的重要因素[6]。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)、基因技術(shù)研究的不斷深入，多種免疫分子、細(xì)胞因子逐漸被了解，成為腫瘤治療、預(yù)后評(píng)估的新指標(biāo)。近年來(lái)，多個(gè)臨床研究[7,8]表明，在腫瘤的形成及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，除了細(xì)胞癌基因的活化及抑癌基因的失活之外，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)TGF-β1表達(dá)水平，以逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視及抑制機(jī)體的免疫功能而確保其自身的發(fā)生發(fā)展。

TGF-β1是具有雙向調(diào)節(jié)功能的多效細(xì)胞因子，在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要部分，既可通過(guò)旁分泌又可通過(guò)自分泌調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞行為。在正常組織及癌變?cè)缙冢琓GF-β1通過(guò)負(fù)性調(diào)控效應(yīng)，使細(xì)胞增殖停留在G1期而不進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞周期而防止過(guò)度增殖；同時(shí)，TGF-β1可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分化或凋亡，維持細(xì)胞正常的極性和細(xì)胞間黏附能力，減少上皮細(xì)胞間質(zhì)化的發(fā)生，從而發(fā)揮抑癌因子的作用[9，10]；然而，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，轉(zhuǎn)導(dǎo)通路任何組分的突變，都可引起信號(hào)的傳遞發(fā)生改變，使機(jī)體細(xì)胞逃避TGF-β1介導(dǎo)的抑癌作用，并促進(jìn)成纖維細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。腫瘤發(fā)展期，由于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子發(fā)生變異，細(xì)胞開(kāi)始抵抗TGF-β1的生物學(xué)作用，導(dǎo)致抑制細(xì)胞周期的作用消失，腫瘤細(xì)胞逐漸生長(zhǎng)，并反饋性地增加TGF-β1的分泌，引起TGF-β1的表達(dá)水平升高。隨著腫瘤發(fā)展，TGF-β1表達(dá)水平在腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境中進(jìn)一步上調(diào)，并可通過(guò)抑制CD8+、CD4+T細(xì)胞，破壞了機(jī)體T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，進(jìn)而減弱人體的免疫監(jiān)視和免疫殺傷能力[11]；同時(shí)，TGF-β1持續(xù)地刺激細(xì)胞從貼壁依賴性生長(zhǎng)向貼壁非依賴性生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞的可塑性升高，細(xì)胞間黏附能力下降，逐漸從基底膜上脫落，并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型以及運(yùn)動(dòng)和侵襲能力；最終導(dǎo)致癌變細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，逐漸生長(zhǎng)或脫離原發(fā)瘤進(jìn)入血液循環(huán)[12]。此外，上調(diào)的TGF-β1水平亦通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，使其逃脫免疫系統(tǒng)的識(shí)別和殺傷,引起腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[13]。Li等[14]研究表明，TGF-β1/Smad4的MH2結(jié)構(gòu)域突變，引起蛋白的核心結(jié)構(gòu)被破壞，無(wú)法形成Smads蛋白復(fù)合體，阻滯了受體依賴的R-Smad磷酸化過(guò)程；或產(chǎn)生不穩(wěn)定的Smads蛋白，使得TGF-β1對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)法發(fā)揮有效的抑制作用，造成腫瘤細(xì)胞的逃逸；而腫瘤細(xì)胞系中TGF-β1的基礎(chǔ)水平能夠影響其生長(zhǎng)，TGF-β1上調(diào)水平與轉(zhuǎn)移相關(guān)，高水平TGF-β1/Smads 通路在腫瘤的免疫逃逸方面起著促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果亦表明，結(jié)直腸癌組織中TGF-β1表達(dá)水平明顯高于正常癌旁組織，復(fù)發(fā)者TGF-β1表達(dá)水平亦明顯高于未復(fù)發(fā)者，且復(fù)發(fā)者癌組織TGF-β1水平與術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。這些皆與TGF-β1抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫逃逸有關(guān)。因?yàn)門GF-β1在正常組織及結(jié)直腸腫瘤前期，作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，正常水平的表達(dá)，能調(diào)控機(jī)體的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤的功效；而在發(fā)生結(jié)直腸腫瘤時(shí)，反饋機(jī)制發(fā)揮作用，促進(jìn)TGF-β1異常升高；術(shù)中切除腫瘤組織，可有效降低局部組織中TGF-β1水平，減輕TGF-β1對(duì)機(jī)體的免疫抑制。而組織中TGF-β1表達(dá)水平相對(duì)較高者仍能受其影響，并繼續(xù)通過(guò)不同的途徑抑制宿主免疫活性細(xì)胞，發(fā)揮免疫抑制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞較早地逃脫免疫監(jiān)視，導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā)[15]。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織通過(guò)上調(diào)TGF-β1表達(dá)而抑制機(jī)體的免疫功能，而高表達(dá)的TGF-β1又下調(diào)了腫瘤細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，增強(qiáng)了腫瘤免疫逃逸的能力，引起結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。從理論上講,探索有效的干預(yù)途徑,下調(diào)機(jī)體TGF-β1的表達(dá)，恢復(fù)正常的免疫功能，可以有效降低結(jié)直腸癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。因此，如何恢復(fù)正常的TGF-β1表達(dá)水平，并通過(guò)其表達(dá)的水平評(píng)估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后,準(zhǔn)確區(qū)分高?；颊?已成為進(jìn)一步提高結(jié)直腸癌生存率的關(guān)鍵及治療的新思路。

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