張?zhí)扉?陳笑蘭 曾其毅

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院兒科中心（廣州 510282）

自噬（autophagy）是指真核細(xì)胞通過生物膜結(jié)構(gòu)包裹自身細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等物質(zhì)，進行降解后產(chǎn)生氨基酸及生物小分子以進行再利用的生物現(xiàn)象。自噬的分類包括微自噬（microautophagy）、分子伴侶介導(dǎo)自噬（chaperone?mediated autophagy）以及巨自噬（macroautopha?gy）。其中巨自噬（下文中簡稱自噬）是以雙層生物膜結(jié)構(gòu)包裹胞漿內(nèi)物質(zhì)形成自噬體，經(jīng)溶酶體降解來回收生物小分子的生物過程，是最常見也是研究最多的細(xì)胞降解通路［1］。自噬現(xiàn)象對維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)合成與降解的平衡具有重要意義，其在多種疾病如感染、肺血管病及腫瘤的病理生理過程中也都發(fā)揮了一定作用［2］。在應(yīng)激時，自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)壞死物質(zhì)、損傷的細(xì)胞器以維持細(xì)胞生存，但過度的自噬也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。

膿毒癥是感染誘導(dǎo)的失調(diào)性宿主免疫反應(yīng)，是兒科重癥監(jiān)護病房的難題之一，當(dāng)膿毒癥進展出現(xiàn)器官功能障礙、休克時，患兒病死率將非常高［4］。《第三版國際膿毒癥定義共識及相關(guān)臨床標(biāo)準(zhǔn)》（SEPSIS?3）強調(diào)了膿毒癥器官功能障礙的發(fā)生，并將序貫器官衰竭評分（SOFA）納入診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。臨床上在足量液體復(fù)蘇的基礎(chǔ)上，對膿毒癥器官功能障礙的患兒有針對的實施器官支持或替代治療也是重要的治療手段。

較多研究顯示自噬在膿毒癥進展與器官功能障礙的發(fā)生中具有一定保護作用，是一個值得研究的治療靶點。雖然自噬的特異性調(diào)控藥物尚未用于臨床，但近年對自噬調(diào)控機制的研究提示，通過重癥監(jiān)護病房常用的如吸氧、腸外營養(yǎng)支持等治療措施也可以對自噬產(chǎn)生干預(yù)起到治療效果。本文就近年自噬發(fā)生機制與膿毒癥器官功能障礙治療的進展作綜述，為以自噬干預(yù)為基礎(chǔ)的臨床診療提供理論依據(jù)和啟發(fā)。

1 自噬的分子機制

自噬的發(fā)生主要有四個步驟：誘導(dǎo)啟動、自噬體形成、轉(zhuǎn)運融合、降解回收。自噬的誘因包括營養(yǎng)物質(zhì)不足、代謝紊亂、創(chuàng)傷及毒素接觸等，而自噬相關(guān)基因Atg（autophagy?related gene）蛋白是細(xì)胞自噬發(fā)生的分子基礎(chǔ)。

在哺乳動物細(xì)胞中的研究顯示，誘因可激活mTOR、AMPK信號通路，改變下游ULK1/ATG13/FIP200復(fù)合物的磷酸化狀態(tài)，啟動胞內(nèi)自噬。細(xì)胞內(nèi)ULK1復(fù)合體和BECN1復(fù)合體定位于自噬泡組裝位點PAS（phagophore as?sembly site），開始募集小分子Atg蛋白，這一過程被稱為核化（Nucleation）［6］。在核化階段，Ⅲ型 PI3K復(fù)合物（ClassⅢPtdins3K complex）是必不可少的工具。Ⅲ型PI3K復(fù)合物可提供PtdIns3P是Atg18和Atg2的定位點，進一步募集更多Atg蛋白到達PAS進行組裝，形成碗狀開口的雙層膜結(jié)構(gòu)，即自噬泡（Phagophore），又稱隔離膜（Isolation Mem?brane），目前認(rèn)為初始自噬泡的物質(zhì)來源與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)［7］。自噬的啟動過程包含多種工具藥的作用位點，也是細(xì)胞對外界刺激進行反饋的物質(zhì)基礎(chǔ)，多種Atg也是功能各異，其分子結(jié)構(gòu)及調(diào)控機制有待進一步探明。

初始自噬泡尺寸小，不足以包裹需要降解的物質(zhì)，需要泛素樣蛋白連接系統(tǒng)（Ubiquitin?like protein conjugation system）來進一步合成自噬泡壁的膜結(jié)構(gòu)。該延長系統(tǒng)由兩部分組成：泛素樣激酶E3及微管相關(guān)蛋白輕鏈LC3（Mi?crotubule?associated protein light chain 3）。膜結(jié)構(gòu)的延長步驟如下，Atg12經(jīng)E1連接酶（Atg7）和E2連接酶（Atg10）作用與Atg5結(jié)合形成Atg12?5復(fù)合物，之后再與Atg16L1結(jié)合生成E3連接酶復(fù)合體（Atg12?5?16L1）。另一方面，LC3經(jīng)具有蛋白酶活性的Atg4切割產(chǎn)生LC3?Ⅰ，LC3?Ⅰ與E1連接酶（Atg7）結(jié)合后遞呈至E2連接酶（Atg3），與前文提及的E3連接酶復(fù)合體（Atg12?5?16L1）相結(jié)合，最終生成LC3?Ⅱ即LC3?PE（Phosphatidylethanolamine，PE，磷脂酰乙醇胺）［8-9］。LC3?PE是自噬泡延長的分子基礎(chǔ)，也是目前唯一穩(wěn)定存留在成熟自噬體上的蛋白標(biāo)志物，被認(rèn)為是衡量組織自噬強度的重要指標(biāo)，在自噬調(diào)控的參照設(shè)置方面有重要意義。

在自噬泡延長到足夠包裹降解物質(zhì)后回發(fā)生閉合，至此，閉合的自噬泡即形成一個成熟的自噬體（Autophago?some）。自噬體與溶酶體（Lysosome）相互靠近融合成自噬溶酶體（Autolysosome），融合后溶酶體內(nèi)的水解酶作用于自噬體包裹的內(nèi)容物，內(nèi)容物降解為生物小分子后自噬溶酶體膜開放，產(chǎn)物釋放入細(xì)胞質(zhì)作為合成底物進行回收利用，自噬過程至此結(jié)束。這一裂解過程是決定細(xì)胞生存的關(guān)鍵，其失調(diào)控可造成水解酶外漏破壞細(xì)胞內(nèi)正常內(nèi)容物激活凋亡信號［10］，而平衡細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控也是目前研究的熱點之一。

2 自噬與膿毒癥器官功能障礙

2.1 自噬與免疫 失調(diào)控的免疫反應(yīng)被認(rèn)為是膿毒癥的發(fā)病機制之一。在這一時期，超負(fù)荷的促炎因子大量生成，導(dǎo)致組織水腫，免疫細(xì)胞局部聚集浸潤，微循環(huán)衰竭，進一步出現(xiàn)器官實質(zhì)組織損傷和功能障礙［11］。

機體發(fā)生膿毒癥時，病原相關(guān)分子模式PAMP可以通過與組織細(xì)胞表面受體如TLR4相識別，可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。此外，在失調(diào)控的免疫反應(yīng)中，大量的促炎因子和聚集的白細(xì)胞可以通過炎癥信號通路誘導(dǎo)組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ERS，線粒體損傷，活性氧過量生成，誘發(fā)保護性自噬反應(yīng)以包裹損傷的細(xì)胞器，限制損傷信號的進一步擴散［12］。

機體炎性因子的釋放也受到自噬水平的影響，研究顯示，敲除Atg5的小鼠在LPS刺激后血清中促炎因子IL?1β大幅升高，肝組織炎性損傷劇烈，而保留自噬功能的野生型小鼠的炎癥反應(yīng)則比較輕［13］。但也有報道［14］顯示，在腦創(chuàng)傷動物模型上使用自噬抑制劑氯喹（chloroquine）在抑制神經(jīng)組織自噬的同時也減輕了促炎因子IL?1β、TNF?α釋放，表現(xiàn)出腦保護作用。可以考慮，在抑制炎性因子損傷方面，有可能存在一個較適宜的自噬水平，通過誘導(dǎo)和抑制將自噬維持在這個范圍內(nèi)有利于對組織器官的保護。

自噬在機體免疫中同樣有清除入侵病原體的作用，即異體吞噬（Xenophagy）。通過這一防御機制，細(xì)胞選擇性識別入侵胞內(nèi)的病原體和有害物質(zhì)，加以包裹限制其擴散并清除［15］。此外，自噬還可以通過調(diào)控機體初期炎癥反應(yīng)的啟動，影響MHCⅠ類和Ⅱ類抗原提呈以及調(diào)節(jié)T細(xì)胞壽命來維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［16］。在動物模型上也證實抑制CD4+T細(xì)胞自噬水平可加劇T細(xì)胞凋亡，同時動物生存率顯著下降［17］，免疫細(xì)胞自噬狀態(tài)的改變也影響到整個機體的正常運作。

2.2 心臟 膿毒癥患者并發(fā)心功能不全時其病死率將大幅升高，其發(fā)病機制包括炎性浸潤，細(xì)胞骨架斷裂，線粒體結(jié)構(gòu)破壞等。其中線粒體損傷及能量代謝障礙被認(rèn)為是重要的治療靶點［18］。自噬可以通過降解損傷的線粒體，改善缺氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞的能量代謝來減輕心肌損傷［19］。而實驗鼠注射LPS構(gòu)建內(nèi)毒素血癥模型后，使用AMPK激動劑或雷帕霉素均可提高組織自噬水平，心肌細(xì)胞凋亡和損傷指標(biāo)均有所降低［20］。證實誘導(dǎo)自噬可以減輕氧超載及LPS對心肌細(xì)胞的損傷作用。除直接干預(yù)心肌細(xì)胞自噬水平外，使用Fasudil抑制ROCK信號通路也觀測到自噬相關(guān)標(biāo)志物表達升高，心肌能量代謝和收縮功能均得到改善［21］。膿毒癥狀態(tài)下心肌細(xì)胞代謝模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，線粒體耗氧加劇并釋放ROS，而自噬體可以包裹限制細(xì)胞內(nèi)ROS擴散。在自噬干預(yù)藥物特異性不足的情況下，可以通過其他相關(guān)信號通路間接誘導(dǎo)自噬，也是改善心肌氧化應(yīng)激來減輕損傷的有效方式。

2.3 肝臟 膿毒癥時肝細(xì)胞代謝狀態(tài)發(fā)生改變，而自噬在肝細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)代謝中同樣發(fā)揮調(diào)控作用。如前述，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏是自噬的重要誘因，肝細(xì)胞通過自噬來分解胞內(nèi)有機物產(chǎn)生小分子以維持代謝需要，分解產(chǎn)物又可以起到負(fù)反饋的作用來限制自噬放大。相比糖類和脂質(zhì)，氨基酸的負(fù)反饋調(diào)控效果最強，當(dāng)氨基酸供給充足時，mTOR信號就會激活而減弱肝細(xì)胞自噬程度［22］。

而一項多中心的臨床研究［23］顯示，早期富含氨基酸的早期腸外營養(yǎng)支持對PICU中的患兒沒有獲益，反而升高了感染發(fā)生率，延長了住院時間。參照前述肝細(xì)胞代謝調(diào)控模型，推測可能是大量氨基酸供給抑制肝臟自噬啟動，削弱了肝細(xì)胞對病理損傷的抵抗能力。

營養(yǎng)支持及胰島素的使用是PICU常用的治療手段，因適度饑餓狀態(tài)有利于維持自噬啟動信號，在腸外營養(yǎng)方面宜控速控量，結(jié)合胰島素將血糖維持在適宜水平，可間接調(diào)控組織自噬水平，從而改善器官損傷。

2.4 肺臟 對膿毒癥小鼠使用羥基酪醇（Hydroxytyrosol）可以通過SIRT/MAPK通路促進肺組織細(xì)胞發(fā)生自噬，而肺水腫、炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子的釋放水平均得到緩解，提示自噬是肺組織炎性損傷的潛在治療靶點［24］。對肺血管細(xì)胞誘導(dǎo)自噬可以抑制缺氧性細(xì)胞增殖保護缺氧引起的肺動脈高壓，而自噬對血管平滑肌細(xì)胞VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用具有兩面性［2，25］，將自噬維持在適宜強度是減輕肺損傷的基礎(chǔ)。

除傳統(tǒng)使用工具藥物干預(yù)自噬的研究外，近幾年出現(xiàn)了關(guān)于吸入低濃度一氧化碳治療膿毒癥肺損傷的報道。一氧化碳顯示出增強肺組織自噬水平，減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤的作用。目前認(rèn)為其作用機制與穩(wěn)定線粒體，促進自噬清除胞內(nèi)異物相關(guān)，但仍需進一步探明，同時國外已啟動該療法的臨床試驗［26］。

臨床上可通過氧療途徑來改善組織缺氧間接干預(yù)自噬，而新的一氧化碳吸入療法也為臨床治療開辟了新思路。

3 總結(jié)

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的降解現(xiàn)象，具有調(diào)控細(xì)胞生存與否的重要作用。在膿毒癥早期即可檢測到組織自噬水平的升高，較多的研究顯示，在膿毒癥時誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可以減輕器官損傷起到保護作用。隨著自噬分子機制研究的深入，而靶向調(diào)控自噬啟動以限制損傷擴散，和抑制自噬過度放大來阻止細(xì)胞凋亡是備受關(guān)注的研究領(lǐng)域。目前基于自噬基礎(chǔ)治療膿毒癥的研究仍主要集中在實驗室階段，但PICU常用的治療技術(shù)如腸外營養(yǎng)支持、氧療以及剛步入臨床試驗階段的一氧化碳療法都可以基于自噬的理論基礎(chǔ)進行改進。已有的數(shù)據(jù)顯示，干預(yù)自噬對改善膿毒癥器官損傷而言是非常有前景的治療策略。而如何評估細(xì)胞自噬的強度，明確自噬與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以及找到特異性干預(yù)措施會是主要的研究方向。

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