江濤， 吳兆映， 史沛聰， 楊婷， 樊瑞智， 許騰， 曹猛， 白津， 宋軍

結(jié)直腸癌是全球第三大惡性腫瘤[1]，每年導(dǎo)致超過70萬人死亡，已嚴(yán)重威脅人類健康[2]。目前，手術(shù)及術(shù)后輔助放化療是臨床上治療結(jié)直腸癌的主要方式。隨著新輔助治療[3]、多學(xué)科綜合治療[4]等方式的改善，結(jié)直腸癌的治療取得了一定的進(jìn)展。但是，結(jié)直腸癌細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致手術(shù)失敗以及患者死亡的主要原因。因此，尋找結(jié)直腸轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)于判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療，提高患者生存率具有重要意義。

端粒酶抑制劑1(PinX1)作為一種端粒酶抑制基因，位于人類染色體8p23，而該區(qū)域在許多人類腫瘤中常發(fā)生高頻雜合缺失[5]。許多研究表明，PinX1基因在人胃癌、乳腺癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌、腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中低表達(dá)并且作為獨(dú)立的預(yù)后因素[6-10]。因此，推測(cè)PinX1為潛在抑癌基因[11]。本實(shí)驗(yàn)通過將構(gòu)建的穩(wěn)定干擾PinX1基因表達(dá)的結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞株注入裸鼠尾靜脈內(nèi)，建立實(shí)驗(yàn)性裸鼠結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，初步探討PinX1基因?qū)Y(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)及細(xì)胞生物研究所；PinX1干擾及陰性對(duì)照慢病毒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；高糖培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自浙江天杭公司；胰酶細(xì)胞消化液、青霉素-鏈霉素溶液(100X)購(gòu)自北京碧云天公司；PinX1抗體購(gòu)自Proteintech公司。兔SP 免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液粉劑、PBS磷酸鹽緩沖液粉劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；30只5周齡，體質(zhì)量為14～15 g雌性BALB/c鼠(合格證號(hào)No.10401300050483；許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004)購(gòu)自北京華阜康生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1天，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)，并按2×105個(gè)/孔接種于六孔板后正常培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)，按照慢病毒操作手冊(cè)進(jìn)行慢病毒感染，并視細(xì)胞狀態(tài)用完全培養(yǎng)基換液(最遲為轉(zhuǎn)染后24 h)，之后正常培養(yǎng)傳代。轉(zhuǎn)染72 h后觀察綠色熒光判斷感染效率并開始嘌呤霉素篩選(HCT116 1 μg/ml)。篩選2周完成穩(wěn)定干擾PinX1及陰性對(duì)照細(xì)胞株的構(gòu)建。

1.2.3 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)PinX1蛋白表達(dá)量 取生長(zhǎng)密度>90%的細(xì)胞，PBS清洗后加裂解液，以刮匙刮下，置于微量離心管中，超聲儀振蕩3次，每次5 s后離心(4 ℃，20 min，13 000 r/min)。取上清，BSA法測(cè)定蛋白濃度。調(diào)整各組蛋白濃度后混合5×loading 緩沖液，金屬浴變性(5 min，100 ℃)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(恒壓100 V,120 min)、電轉(zhuǎn)(恒流200 mA，120 min，冰水浴)、脫脂奶粉封閉2 h、一抗4 ℃過夜孵育。次日TBST漂洗數(shù)次后二抗孵育1 h，再TBST漂洗數(shù)次，化學(xué)發(fā)光顯色、拍照，GAPDH為內(nèi)參照。

1.2.4 結(jié)直腸癌細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶液消化，用含血清培養(yǎng)基終止消化。分別收集基因干擾組(HCT116-KD)和陰性對(duì)照組(HCT116-NC)和空白對(duì)照組(HCT116-CON)細(xì)胞懸液，用無菌PBS清洗3次，顯微鏡下計(jì)數(shù)，最后以2×106個(gè)細(xì)胞/0.2 ml/只(每組10只，共3組)經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)。制備的細(xì)胞懸液需放置在冰盒內(nèi)，于30 min內(nèi)完成尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組 實(shí)驗(yàn)用裸鼠飼養(yǎng)在徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF條件下，每日給予食物、滅菌飲水、12 h光照，每3天更換墊料，遵守?zé)o菌操作原則，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱質(zhì)量，編號(hào)用于本實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)對(duì)象共分為基因干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組3組，每組10只。

1.2.6 裸鼠結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建 操作者先用白熾燈照射裸鼠尾巴3～5 min，擴(kuò)張血管。然后將裸鼠固定在暴露尾部的固定器內(nèi)，壓住小鼠尾巴根部，用75%乙醇棉球反復(fù)擦拭小鼠尾部，進(jìn)一步擴(kuò)張血管，并使小鼠尾部表皮軟化。此時(shí)，助手協(xié)助用1 ml注射器吸取制備好的細(xì)胞懸液，排盡空氣，置于冰盒備用。操作者以左手食指與拇指拉緊、繃直小鼠尾巴，右手持注射器選擇距尾尖1/4或1/3處平行于尾部進(jìn)針。開始時(shí)少量緩慢注射，如無阻力，則表示針頭進(jìn)入裸鼠尾靜脈內(nèi)，這時(shí)可保持穩(wěn)定注射。注射完畢后用無菌棉球按壓止血。注射成功后將裸鼠飼養(yǎng)于SPF條件下的動(dòng)物房，觀察其攝食、活動(dòng)等生長(zhǎng)狀態(tài)，并做好記錄。

1.2.7 裸鼠的解剖、觀察與處理 將自然死亡的裸鼠以及尾靜脈注射后第45天處死裸鼠仰臥固定于平板上，用眼科剪依次從頸部至尾部剖開皮膚及皮下組織，暴露胸腔、腹腔臟器，小心分離各個(gè)臟器，觀察各臟器表面有無明顯轉(zhuǎn)移灶及形態(tài)的變化。將肝、脾、肺等臟器取出，用包埋盒標(biāo)記，置于4%甲醛中浸泡固定，備切片病理檢查。

1.2.8 裸鼠轉(zhuǎn)移瘤的病理學(xué)檢查 將裸鼠體內(nèi)臟器按照常規(guī)病理取材，固定后脫水、浸蠟、常規(guī)包埋，然后2 μm切片。切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，然后經(jīng)HE染色后，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察各臟器轉(zhuǎn)移情況。

1.2.9 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)移瘤PinX1的表達(dá) 取經(jīng)病理科專家證實(shí)為腫瘤轉(zhuǎn)移器官的相應(yīng)蠟塊，4 μm厚切片，置于65 ℃烤箱烤片2 h,二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，切片置于檸檬酸鹽中高溫高壓修復(fù)抗原，PBS沖洗后，以3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10 min，PBS再?zèng)_洗，滴加一抗(1∶100稀釋)，4 ℃過夜。第2天室溫下復(fù)溫30 min后，PBS沖洗后二抗及二抗增敏劑室溫孵育各15 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師雙盲對(duì)染色標(biāo)本共同評(píng)估。結(jié)果判定：PinX1染色陽(yáng)性呈棕黃色，主要位于細(xì)胞核，部分位于胞質(zhì)及胞膜。根據(jù)PinX1陽(yáng)性染色程度，分為0～3級(jí)(0代表陰性；1代表弱陽(yáng)性；2代表中等陽(yáng)性；3代表強(qiáng)陽(yáng)性)。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比也分為4級(jí)：1(0～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)以及4(76%～100%)。PinX1蛋白水平采用免疫反應(yīng)性評(píng)分(IRS)來評(píng)估，免疫反應(yīng)性評(píng)分是由免疫程度等級(jí)分?jǐn)?shù)與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分?jǐn)?shù)相乘所得。最終計(jì)算出免疫反應(yīng)性評(píng)分，分為4級(jí)：陰性(IRS:0)，弱陽(yáng)性(IRS:1～3)，中等陽(yáng)性(IRS:4～6)以及強(qiáng)陽(yáng)性(IRS:8～12)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 低表達(dá)PinX1結(jié)直腸癌細(xì)胞株的構(gòu)建

在經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，顯微鏡下觀察結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116的GFP熒光表達(dá)，以明視野作為對(duì)照，HCT116細(xì)胞的PinX1干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到75%以上(見圖1)，說明轉(zhuǎn)染效率較高。Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，同陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，PinX1干擾組PinX1蛋白表達(dá)水平明顯下降(見圖2)。

2.2 實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察

在接種癌細(xì)胞后1～2周里，各組裸鼠體質(zhì)量均快速增長(zhǎng)。從第30天起，PinX1干擾組裸鼠出現(xiàn)消瘦、活動(dòng)減緩等癥狀，部分出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、弓背、明顯消瘦等惡病質(zhì)表現(xiàn)，PinX1干擾組裸鼠在接種癌細(xì)胞后35 d、38 d時(shí)各有1只死亡。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組雖有部分裸鼠出現(xiàn)消瘦、倦怠等癥狀，但未出現(xiàn)裸鼠死亡。PinX1干擾組裸鼠體質(zhì)量高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組[(19.42±2.67)比(16.24±2.17)、(15.89±3.08)，P<0.05]。見圖3。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞(熒光素染色法 ×200)1A、1B：空白對(duì)照組； 1C、1D：陰性對(duì)照組；1E、1F：PinX1干擾組；1A、1C、1E：普通顯微鏡下觀察；1B、1D、1F：熒光素顯微鏡下觀察

圖2 Western blot分析PinX1表達(dá)水平2A：空白對(duì)照組；2B：陰性對(duì)照組；2C：PinX1干擾組

圖3 裸鼠體質(zhì)量對(duì)比

2.3 實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移型裸鼠的大體觀察

將自然死亡裸鼠以及接種結(jié)直腸癌細(xì)胞后第45天處死裸鼠解剖觀察，發(fā)現(xiàn)各組裸鼠心、肺、脾、腎等均未見肉眼轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)；PinX1干擾組有9只、陰性對(duì)照組6只、空白對(duì)照組7只見肝轉(zhuǎn)移，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PinX1干擾組肝表面發(fā)現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移，肝表面布滿灰白色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，粗糙不平，多數(shù)為針頭大小，部分大轉(zhuǎn)移灶約5 mm，或融合成片；而相應(yīng)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目較干擾組明顯減少，個(gè)別肝僅見散在單個(gè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)甚至整個(gè)肝肉眼未見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(見圖4)。PinX1干擾組肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目多于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組[(21.10±7.50)比(6.20±5.51)、(6.40±5.10)，P<0.01](見圖5)。

圖4 實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型裸鼠解剖后標(biāo)本大體觀察

圖5 裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目對(duì)比

2.4 實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模型裸鼠病理學(xué)檢查

將甲醛固定后的裸鼠各個(gè)器官組織切片做HE 染色，光鏡下觀察結(jié)果顯示，裸鼠肺部未見明顯轉(zhuǎn)移灶(見圖6)。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的裸鼠肝內(nèi)有大量核大深染的腫瘤細(xì)胞及異形細(xì)胞生長(zhǎng)，形狀不規(guī)則，腫瘤細(xì)胞周圍可見正常肝組織萎縮、肝細(xì)胞變性壞死的肝細(xì)胞等。PinX1干擾組可見轉(zhuǎn)移灶密集分布，并相互連接成片狀，周圍肝組織小葉結(jié)構(gòu)紊亂(見圖7)。

圖6 裸鼠結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移瘤組織學(xué)變化(HE ×200)裸鼠肺組織形態(tài)無明顯異常，未見明顯轉(zhuǎn)移灶

圖7 結(jié)直腸癌裸鼠肝轉(zhuǎn)移瘤組織學(xué)變化(HE ×200)轉(zhuǎn)移灶密集分布，并相互連接成片狀，周圍肝組織小葉結(jié)構(gòu)紊亂

2.5 免疫組化染色檢測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤PinX1的表達(dá)情況

裸鼠肝轉(zhuǎn)移瘤組織PinX1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，PinX1基因陽(yáng)性染色呈棕黃色，主要位于細(xì)胞核中，部分位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜中。PinX1干擾組腫瘤組織PinX1基因表達(dá)水平較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組明顯降低，PinX1干擾組免疫組化染色免疫反應(yīng)性評(píng)分明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組[(2.90±2.77)比(6.30±2.95)、(6.10±3.41)，P<0.05]。見圖8。

圖8 免疫組化染色檢測(cè)結(jié)直腸癌裸鼠肝轉(zhuǎn)移瘤PinX1的表達(dá)情況

3 討論

結(jié)直腸癌是目前全球范圍內(nèi)對(duì)人類生命危害最大的惡性腫瘤之一，已躍居世界第三大腫瘤，并且發(fā)展速度極快。近年來，隨著新輔助治療、多學(xué)科綜合治療等治療理念的改變，結(jié)直腸癌的治療取得了一定的進(jìn)步，然而，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者長(zhǎng)期生存及預(yù)后的最主要因素。截至目前，結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面確切的分子機(jī)制仍不清楚。因此，通過尋找結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)于降低結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，提高生存率具有重要意義。

端粒酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[12-14]，端粒酶催化亞基(hTERT)是端粒酶的催化活性中心，維持端粒酶長(zhǎng)度，并且與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。端粒結(jié)合因子-1(TRF1)是端粒結(jié)合蛋白的一種，可以二聚體的形式結(jié)合在染色體的端粒末端并對(duì)其長(zhǎng)度起負(fù)調(diào)節(jié)作用。PinX1基因是內(nèi)源性端粒酶抑制因子，位于人類染色體8p23，可以同時(shí)作用hTERT與TRF1，下調(diào)端粒酶活性，縮短端粒長(zhǎng)度，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是腫瘤抑制基因[16]。許多研究表明，在肝癌、胃癌、乳腺癌和卵巢癌中PinX1基因表達(dá)下降[17-19]。此外，PinX1低表達(dá)可以促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且其過表達(dá)亦可抑制胃癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移并改善患者的預(yù)后[18]，在對(duì)卵巢癌和鼻咽癌的研究中得出了類似的結(jié)論[20-21]。因此，PinX1可能在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，PinX1基因可能通過MMP2信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但是PinX1基因參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)體內(nèi)研究尚未見報(bào)道。

本研究在成功構(gòu)建穩(wěn)定干擾PinX1及陰性對(duì)照HCT116細(xì)胞株后，采用尾靜脈注射法構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性裸鼠結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移模型。定期稱量裸鼠體質(zhì)量并觀察其攝食、活動(dòng)及精神狀況；45 d后處死裸鼠，從大體水平及顯微鏡下觀察裸鼠各臟器轉(zhuǎn)移情況，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PinX1蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PinX1干擾組裸鼠體質(zhì)量明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.01)。穩(wěn)定干擾PinX1基因表達(dá)的PinX1干擾組裸鼠肝表面均發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。PinX1干擾組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組 (P<0.01)。

綜上所述，PinX1基因能夠明顯降低結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移能力。本研究為進(jìn)一步闡明PinX1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用提供了新的證據(jù)，PinX1基因有可能成為結(jié)直腸癌靶向治療的有效靶點(diǎn)。

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