范一博，車曉芳，趙歡，胡雪君，曲秀娟，劉云鵬

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1. 腫瘤內(nèi)科； 2. 呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科，沈陽 110001）

microRNA （miRNA） 是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控［1］。近年來，越來越多的研究［2-7］顯示，microRNA參與多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，影響腫瘤患者的預(yù)后。然而，microRNA-1183是否促進(jìn)胃癌細(xì)胞中的增殖和轉(zhuǎn)移尚不清楚。本研究探討了microRNA-1183對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803增殖和轉(zhuǎn)移的影響，以及CBL-B和Akt通路在其中的作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確microRNA-1183對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Akt和phosph-Akt抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，CBL-B和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞系MGC803購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。人胃癌細(xì)胞MGC803生長(zhǎng)于含有12 U/L慶大霉素、100 mL/L滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d左右傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 MTT法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞株接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染microRNA陰性對(duì)照及microRNA-1183模擬物，72 h后每孔加入MTT溶液 （5 mg/mL） 25 μ L，繼續(xù)孵育4 h，棄掉孔內(nèi)上清液。加入二甲亞砜200 μ L/孔，振蕩至結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上選擇570 nm波長(zhǎng)，空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光值，計(jì)算兩者的增值率。

1.2.3 Transwell法檢測(cè)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞MGC803，胰酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入無血清的RPIM 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)至1×105/mL加入Transwell小室（Corning） 上室。下室加入2.5%胎牛血清的RPIM培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 取出Transwell，脫脂棉擦拭表面的細(xì)胞，PBS沖洗上室。瑞士吉姆薩染色后，PBS沖洗風(fēng)干，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：分別收集轉(zhuǎn)染microRNA陰性對(duì)照及microRNA-1183模擬物的胃癌細(xì)胞MGC803，冰上裂解后，提取上清的蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。將樣品 （30 μ g/道） 在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳約3 h，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶的TTBS封閉1 h后，按Marker標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入兔抗人CBL-B抗體 （1∶1 000） 、pAkt抗體 （1∶500） 、Akt 抗體 （1∶1 000） 和 β-actin抗體 （1∶1 000） 4 ℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠（1∶800） 或羊抗兔二抗 （1∶800） 室溫作用30 min后，再應(yīng)用TTBS洗4次，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)：將質(zhì)粒 （500 ng） 、microRNA-1183模擬物或陰性對(duì)照（50 nmol/L） 及pRL-TK （5 ng） 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞 72 h后，雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所得數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以±s表示。2組間比較采用 t 檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 microRNA-1183促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖和轉(zhuǎn)移

為證實(shí)microRNA-1183對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的作用，將microRNA-1183瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MGC803細(xì)胞，實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，microRNA-1183的表達(dá)升高了4.2倍 （圖1A） 。同時(shí)，MTT法結(jié)果證實(shí)，microRNA-1183可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖 （圖1B） 。Transwell法結(jié)果證實(shí)，microRNA-1183可促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803的轉(zhuǎn)移 （圖1C） 。

2.2 microRNA-1183直接與CBL-B 3’UTR區(qū)結(jié)合

為了明確microRNA-1183促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan及microRNA.org預(yù)測(cè)microRNA-1183的靶基因，結(jié)果顯示，CBL-B等是microRNA-1183的靶基因。BLAST對(duì)比分析結(jié)果顯示，microRNA-1183與CBL-B的3’UTR區(qū)有直接結(jié)合位點(diǎn) （圖2A） 。進(jìn)一步過表達(dá)microRNA-1183后，CBL-B的表達(dá)以濃度依賴的方式下調(diào) （圖2B） 。熒光報(bào)告素酶結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染模擬物microRNA-1183后，熒光素酶的活性明顯降低 （圖2C） ，說明CBL-B是microRNA-1183的靶基因。

2.3 CBL-B抑制胃癌MGC803細(xì)胞的增殖

為證實(shí)CBL-B對(duì)胃癌MGC803增殖的作用，Western blotting驗(yàn)證CBL-B的敲除效率情況 （圖3A） 。MTT法結(jié)果顯示，瞬時(shí)敲除CBL-B后，細(xì)胞增殖的能力明顯增強(qiáng)。Transwell法結(jié)果顯示，敲除CBL-B后，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。結(jié)果表明，CBL-B抑制了胃癌細(xì)胞MGC803的增殖 （P ＜ 0.01，圖3B） 。

2.4 microRNA-1183/CBL-B/Akt信號(hào)軸促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖與轉(zhuǎn)移

圖1 microRNA-1183促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖和轉(zhuǎn)移Fig.1 microRNA-1183 promotes the proliferation and metastasis of MGC803 cells

圖2 CBL-B是microRNA-1183的靶基因Fig.2 CBL-B is the target gene of microRNA-1183

Western blotting檢測(cè)microRNA-1183瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到MGC803細(xì)胞48 h后，CBL-B及下游分子Akt的表達(dá)變化。結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-1183后，CBL-B的表達(dá)明顯下調(diào)，伴隨Akt的活化明顯增強(qiáng)，見圖4。

3 討論

microRNA的異常表達(dá)可影響多種腫瘤患者的預(yù)后［2-7］。已有文獻(xiàn)［8］報(bào)道，microRNA-1183在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中高表達(dá)，且可作為診斷疾病的分子標(biāo)志物。然而，目前microRNA-1183在腫瘤中發(fā)揮的作用尚未見報(bào)告。本研究證實(shí)，胃癌中microRNA-1183可促進(jìn)其增殖及轉(zhuǎn)移。

既往研究［8］顯示，胃癌患者血漿microRNA-1183的表達(dá)可作為診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物標(biāo)志物，其中CXCR4、 EGF和EGFR都是其靶基因。然而，microRNA-1183是否存在其他的靶基因，及其在胃癌中的增殖作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示，microRNA-1183可以通過濃度依賴的方式促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC803的增殖和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提示其參與胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。

圖3 CBL-B抑制MGC803細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移Fig.3 CBL-B inhibited the proliferation and metastasis of MGC803 cells

圖4 Western blotting過表達(dá)microRNA-1183后CBL-B、pAkt和Akt的表達(dá)Fig.4 Western blotting shows the expression of CBL-B，p-Akt，and Akt in MGC803 cells overexpressing microRNA-1183

既往關(guān)于microRNA-1183的功能及靶基因僅有1篇文章報(bào)告。通過TargetScan及microRNAorg預(yù)測(cè)CBL-B可能是microRNA的靶基因。CBL-B是一種抑癌基因，通過泛素化降解受體或非受體酪氨酸激酶，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)microRNA-1183后CBL-B的表達(dá)明顯下調(diào)，并伴隨著Akt的活化。這些結(jié)果提示，microRNA-1183通過負(fù)向調(diào)控CBL-B促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，microRNA-1183可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其通過抑制CBL-B的表達(dá)促進(jìn)了Akt的活化，提示microRNA-1183/CBL-B/Akt通路是促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。本研究為進(jìn)一步明確胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找治療胃癌的靶分子提供重要的科學(xué)意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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