張利華，張麗艷，張小康，徐超龍，周義

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，沈陽 110034）

阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 又稱老年癡呆癥，是一種以記憶、學(xué)習(xí)、認(rèn)知功能改變?yōu)橹饕卣鞯纳窠?jīng)系統(tǒng)退行性疾病。病因假說很多，其中β-淀粉樣蛋白 （β-amyloid protein，A β） 異常沉積占主導(dǎo)地位。其主要病理特征是在患者大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)，此外還有神經(jīng)元缺失、神經(jīng)元突觸異常等病理改變。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣泛的營養(yǎng)因子，在突觸可塑性、神經(jīng)元存活方面起著關(guān)鍵作用。最近的研究［1］報(bào)道，AD患者的血清中BDNF水平降低，且發(fā)現(xiàn)健康老年受試者的腦脊液中BDNF水平低下可能預(yù)示著未來會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知衰退。哺乳動(dòng)物中的經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道蛋白 （canonical transient receptor potential channel，TRPC） 是一種非典型鈣離子通道，與神經(jīng)系統(tǒng)的生長、增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。BDNF通過激活TRPC3促進(jìn)樹突棘的生長發(fā)育［2］?？逦魍⊥ㄟ^促進(jìn)TRPC6和磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)從而治療腦缺血損傷［3］。在癲癇大鼠海馬神經(jīng)元初代培養(yǎng)中，BDNF和TRPC3表達(dá)增加對(duì)癲癇引起的細(xì)胞損傷起保護(hù)作用［4］。在視網(wǎng)膜缺血性損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，BDNF/酪氨酸激酶受體B通過調(diào)節(jié)TRPC3/6通道的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用。

本課題組的前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，在A β誘導(dǎo)的AD小鼠模型中，TRPC4表達(dá)增加。但目前關(guān)于BDNF和TRPC3在A β所致的AD模型中的關(guān)系及作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用SD大鼠側(cè)腦室注射寡聚型A β 1-42的方法模擬AD［6］，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （RTPCR） 和Western blotting檢測大鼠海馬組織中TRPC3和BDNF mRNA和蛋白表達(dá)，探討它們之間的關(guān)系，為AD發(fā)病機(jī)制研究提供新的證據(jù)，同時(shí)也為預(yù)防和治療AD提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物：24只5周齡200～220 g的SPF級(jí)雄性SD大鼠 （遼寧長生生物技術(shù)有限公司） 。

1.1.2 試劑：A β和BDNF兔單克隆抗體 （英國Abcam公司） ；重組人源BDNF （美國Peprotech公司） ；總RNA小量制備試劑盒 （美國Axygen公司） ；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （加拿大Abm公司） ；BCA 蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 （上海碧云天公司） ；TRPC3兔多克隆抗體 （臺(tái)灣Arigo公司） ；β-actin小鼠單克隆抗體和辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG （H+L）（美國Proteintech公司） ；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L） （北京中杉金橋公司） 。

1.2 方法

1.2.1 A β 1-42寡聚化處理：注射前，將A β 1-42室溫放置1 h，低速離心10 min，溶解在滅菌PBS溶液中 （濃度為1 μ g/μ L） ，并在37 ℃恒溫箱中孵育48 h誘導(dǎo)寡聚化，放置冰上備用。

1.2.2 AD模型制備：大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g） 麻醉，頭部消毒后將皮膚沿矢狀線切開 1 cm，棉簽蘸碘伏消毒，剔除骨膜，完全暴露顱骨前囟，置于腦立體定位儀上，側(cè)腦室導(dǎo)管放置位置根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定，前囟后 0.8 mm，中線向右旁開 1.5 mm，深度3.5 mm。置管后在管周前、左、右3個(gè)位置分別擰入小螺絲半固定，涂以牙科水泥固定，晾干后縫合。肌注青霉素5 d預(yù)防感染。待手術(shù)應(yīng)激消失后，用微量注射器經(jīng)導(dǎo)管緩慢注射A β 1-42 10 μ L，注射速度約為2 μ L/min，注射結(jié)束留針3 min，使溶液充分彌散。對(duì)照組注射同等劑量的PBS溶液。

1.2.3 BDNF給藥：根據(jù)說明書溶解和稀釋BDNF，分裝后置于-40 ℃冰箱低溫保存，避免反復(fù)凍融。A β 1-42給藥14 d后即水迷宮實(shí)驗(yàn)前1 d，從第15天起，給予AD+BDNF組大鼠BDNF水溶液，劑量為10 μ L（0.025 μ g/μ L） ，持續(xù)給藥5 d。

1.2.4 Morris水迷宮行為學(xué)檢測：A β 1-42給藥后第16天，利用MT-200 Morris 水迷宮跟蹤分析系統(tǒng) （成都泰盟科技有限公司） 檢測各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。前5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，將待測大鼠頭部面向池壁放入水中，讓其尋找目標(biāo)象限內(nèi)的隱藏平臺(tái)，所用時(shí)間即逃避潛伏期，依據(jù)該時(shí)間的長短檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，3次/d，平臺(tái)位置不動(dòng)，象限不重復(fù)。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將平臺(tái)撤去，記錄大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)以及在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間，以檢測大鼠的空間記憶能力。

1.2.5 RT-PCR 檢測TRPC3和BDNF mRNA的表達(dá)：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠斷頭取海馬組織，-80 ℃超低溫冰箱保存，以備RT-PCR實(shí)驗(yàn)以及Western blotting實(shí)驗(yàn)使用。提取大鼠海馬組織總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所需引物由金斯瑞生物科技公司合成。β-actin上游引物5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’，下游引物5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’；BDNF上游引物5’-CTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCG-3’，下游引物5’-CAGCCTTCCTTCGTGTAACCCAT-3’；TRPC3，上游引物5’-CTGGCCAACATAGAGAAGGAGT-3’，下游引物5’-CACCGATTCCAGATCTCCAT-3’。瓊脂糖凝膠成像結(jié)果采用Gel Image System軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 Western blotting 檢測 TRPC3 和BDNF蛋白的表達(dá)：向低溫保存的海馬組織中加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液200 μ L，12 000 r/min離心5 min。取上清液，采用 BCA 法得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度計(jì)算得出蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μ g/10 μ L，室溫下SDS-PAGE凝膠電泳1 h，TRPC3 （分子量91 000） 采用濕轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)膜2 h，BDNF （分子量15 000） 采用半干轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)膜20 min，放入5%脫脂牛奶中搖床封閉1 h，加入適度稀釋度的一抗TRPC3 （1∶2 000） 、BDNF （1∶2 000）、 β-actin （1∶5 000） 4 ℃孵育過夜。翌日TBST漂洗15 min×3次，加入適度稀釋的二抗（1∶2 000） ，冰上孵育2 h，TBST漂洗15 min×3次，最后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) （中國天能公司） 進(jìn)行ECL顯影，用Gel Image System 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BDNF對(duì)AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用

側(cè)腦室導(dǎo)管A β 1-42給藥14 d后，從第15天開始，BDNF連續(xù)給藥5 d，期間進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。第5天大鼠逃避潛伏期AD組較PBS組延長，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異［分 別 為（31.06±4.01） s和（24.23±4.62） s，P ＜ 0.05］；第6天穿越平臺(tái)次數(shù)AD組較PBS組減少（分 別 為3.25±0.45和6.62±0.46，P ＜ 0.05） ，表 明AD組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。而第5天大鼠逃避潛伏期AD+BDNF組較AD組縮短［分別為（23.30±4.84） s和（31.06±4.01） s，P ＜ 0.05］； 第6天穿越平臺(tái)次數(shù)AD+BDNF組較AD組增加 （分別為5.83±0.75和3.25±0.45，P ＜ 0.05） ，表明BDNF對(duì)AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用。見圖1。

圖1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組大鼠行為學(xué)比較Fig.1 Behavioral comparisons of each group of rats in the Morris water maze

2.2 BDNF促進(jìn)TRPC3 mRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，AD組與PBS組相比，BDNF和TRPC3 mRNA相對(duì)含量均降低 （P ＜ 0.05） 。AD+BDNF組與AD組相比，TRPC3 mRNA相對(duì)含量增加 （P ＜0.05） 。見圖2。

2.3 BDNF促進(jìn)TRPC3 蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，AD組與PBS組相比，BDNF和TRPC3 蛋白相對(duì)含量均降低 （P ＜ 0.05） ，AD+BDNF組與AD組相比，TRPC3 蛋白相對(duì)含量增加 （P ＜ 0.05） 。見圖3。

3 討論

研究［7］表明，A β在腦內(nèi)沉積形成老年斑是AD最具特征的病理改變，與大腦認(rèn)知障礙密切相關(guān)。A β在AD的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用，但它通過何種機(jī)制造成神經(jīng)元損傷，尚不清楚。在轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦組織中觀察到BDNF的降低可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)元萎縮和突觸損傷，而BDNF的上調(diào)可以控制AD的認(rèn)知衰退［8］。本研究中，AD組大鼠BDNF表達(dá)下降，空間學(xué)習(xí)記憶能力減退；當(dāng)給予AD大鼠一定劑量的BDNF時(shí)，可明顯改善其空間學(xué)習(xí)記憶能力，與之前ZHANG等［9］的研究結(jié)果一致。

圖2 RT-PCR檢測大鼠海馬區(qū)BDNF和TRPC3 mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Expression of BDNF and TRPC3 mRNA in the hippocampus of rats detected by RT-PCR

圖3 Western blotting檢測各組大鼠海馬區(qū)BDNF 和TRPC3蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of BDNF and TRPC3 protein in the hippocampus detected by Western blotting

有研究［10］表明，在心肌缺血性損傷及癲癇大鼠模型中，BDNF與TRPC3/6協(xié)同作用，對(duì)神經(jīng)元損傷起保護(hù)作用。本研究中，AD組大鼠TRPC3表達(dá)下降，當(dāng)給予AD大鼠一定劑量的BDNF時(shí)，TRPC3 mRNA和蛋白水平均明顯增加，說明BDNF可能通過上調(diào)TRPC3從而發(fā)揮其改善AD大鼠認(rèn)知障礙的作用，這在AD模型中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。

有研究［11］表明，BDNF通過鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶激活TRPC5或TRPC6通道從而誘導(dǎo)谷氨酸亞基1翻譯和突觸生長。也有研究［12］表明，哌嗪類化合物通過激活DAG，進(jìn)而引起TRPC3/6/7介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，發(fā)揮BDNF樣神經(jīng)營養(yǎng)作用。但在AD模型中，BDNF通過何種途徑調(diào)控TRPC3的表達(dá)，仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究表明，BDNF可能通過上調(diào)TRPC3表達(dá)，從而發(fā)揮其對(duì)AD大鼠認(rèn)知障礙的改善作用，但其具體機(jī)制有待研究。這可能對(duì)臨床預(yù)防和治療AD有一定幫助。

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