邢海會，丁曉慧，解輝，王忠華，謝菊華，陳豐洋，羅崟洲，周勝男

（沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽 110034）

隨著人口老齡化進(jìn)程的加劇和發(fā)病年齡的年輕化，缺血性腦卒中已成為危害人類的主要疾病。缺血性腦卒中具有較高的致殘率和死亡率。已有研究［1］表明，腦缺血發(fā)生后炎癥反應(yīng)在再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。其作用的差異取決于神經(jīng)炎癥持續(xù)的時間和釋放的細(xì)胞因子的性質(zhì)［2］。Toll樣受體4（ Toll-like receptor 4，TLR4） 是Toll樣受體家族亞型之一，在炎癥發(fā)生的級聯(lián)反應(yīng)中起到重要作用［3］。小鼠急性腦缺血再灌注后阻斷TLR4或敲除TLR4基因后對缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［4-5］，但是WANG等［6］報(bào)道TLR4對腦組織具有保護(hù)作用。這表明腦缺血再灌注損傷可能與TLR4的表達(dá)有關(guān)，但是TLR4在腦缺血再灌注后不同時間點(diǎn)的作用還未見報(bào)道。因此，進(jìn)一步研究TLR4在腦缺血再灌注損傷中不同時間點(diǎn)的作用意義重大。

TAK-242是一種小分子環(huán)己烯衍生物，為TLR4的特異性配體，腹腔注射后可透過血腦屏障，其作為TLR4的拮抗劑已被成功用于腦損傷的研究中［4，7］。核轉(zhuǎn)錄因子κ B抑制蛋白激酶 （nuclear transcription factor kappa B inhibitory protein kinase，IKK α/β） 為TLR4通路下游激酶，腦缺血發(fā)生后發(fā)生磷酸化，即形成磷酸化的IKK α/β （P-IKK α/β）參與腦缺血損傷［4］。本研究通過大鼠腹腔注射TAK-242阻斷TLR4的作用，探討TLR4及P-IKK α/β在大鼠腦缺血再灌注后不同時間點(diǎn)的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SPF級SD大鼠108只，體質(zhì)量 （257.17±18.97） g，購自遼寧省本溪市長生生物技術(shù)有限公司。TLR4小鼠單克隆抗體 （美國Origene公司） 、兔抗大鼠P-IKK α/β、IKK α多克隆抗體 （美國Cell Signaling 公司） ，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG （中國中杉金橋公司） ，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG （美國Santa Cruz Biotechnology公司） ，β-actin （中國恩晶生物公司） 。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備：將大鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組、缺血組（ 缺血+生理鹽水） ，缺血+TAK（TLR4拮抗劑） 組。每組36只大鼠，每組取術(shù)后1、3、7、14 d 4個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)9只大鼠，其中3只做HE染色，6只做Western blotting。各組大鼠分別在術(shù)后1、3、7和14 d取材。大鼠用20%烏拉坦（ 1 500 mg/kg）麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、迷走神經(jīng)、頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈近心端，于頸總動脈遠(yuǎn)心端放置一備好的絲線，勿收緊線結(jié)。經(jīng)頸總動脈插入魚線至頸內(nèi)動脈，長度為2 cm（ 頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處），以阻斷大腦中動脈，結(jié)扎備好的線結(jié)固定魚線。缺血+TAK組在大鼠腦缺血1 h后腹腔注射TAK-242（ 3 mg/kg）［4］，缺血組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，缺血組和缺血+TAK組均在魚線插入2 h后拔出，實(shí)現(xiàn)缺血后再灌注。假手術(shù)組只分離右側(cè)頸總動脈、迷走神經(jīng)和頸外動脈。

1.2.2 神經(jīng)功能評分：大鼠手術(shù)前和手術(shù)后清醒至術(shù)后24 h內(nèi)均采用Zealonga評分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0分，正常，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，提尾時缺血對側(cè)前肢屈曲，不能伸直；2分，行走時身體向缺血對側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分，向缺血病灶對側(cè)跌倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.2.3 組織切片的制備及HE染色：各組大鼠分別在術(shù)后1、3、7和14 d 取材，部分大鼠用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流后取腦，切取距前囟前1 mm至前囟后3 mm制作石蠟切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化，進(jìn)行HE染色，然后經(jīng)脫水和透明，中性樹膠封片，鏡下觀察各組大鼠大腦皮質(zhì)的病理學(xué)變化。

1.2.4 Western blotting檢測缺血側(cè)大腦皮質(zhì)TLR4及P-IKK α/β的表達(dá)：各組動物分別在術(shù)后1、3、7和14 d 新鮮取腦，留取距前囟前1 mm至前囟后3 mm區(qū)域內(nèi)大腦皮質(zhì)（ 約50 mg） ，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，Western blotting檢測TLR4及P-IKK α/β在缺血腦皮質(zhì)的表達(dá)。腦組織經(jīng)勻漿離心、測定蛋白質(zhì)濃度，采用8%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，抗TLR4抗體（ 1∶500） 室溫2 h，再孵育相應(yīng)二抗室溫作用1.5 h，以β-actin作為內(nèi)參，ECL發(fā)光后采用Tanon GIS軟件對條帶進(jìn)行定量分析，以目的蛋白值比內(nèi)參值作為TLR4的相對表達(dá)量?？筆-IKK α/β抗 體（ 1∶2 000） 或抗IKK α抗 體（ 1∶800）替代抗TLR4抗體，檢測P-IKK α/β在大腦皮質(zhì)的表達(dá)，以P-IKK α/β值比IKK α值作為P-IKK α/β的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀，Zealonga評分均為0分，缺血組Zealonga評分為2.38±0.493，缺血+TAK組為1.92±0.739。與假手術(shù)組相比，缺血+TAK組和缺血組的Zealonga評分均顯著增加 （P ＜ 0.01） ，且缺血+TAK組的Zealonga評分低于缺血組 （P ＜ 0.05） 。

2.2 大腦皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，著色分布均勻 （圖1） 。缺血+TAK組和缺血組不同時間點(diǎn)均可觀察到不同程度的病理學(xué)改變 （圖2） 。術(shù)后1和3 d，缺血組和缺血+TAK組腦組織均有不同程度的水腫，尤其是術(shù)后1 d，缺血組和缺血+TAK組細(xì)胞核周圍的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，且缺血＋TAK組細(xì)胞水腫較缺血組嚴(yán)重。術(shù)后7 d，缺血組腦組織結(jié)構(gòu)疏松，出現(xiàn)液化性壞死，呈篩網(wǎng)狀，神經(jīng)元大量消失，大量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)急性腦損傷的病理學(xué)改變，而缺血+TAK組腦組織結(jié)構(gòu)破壞輕于缺血組，尚可見正常的神經(jīng)元形態(tài)。術(shù)后14 d，缺血組神經(jīng)元消失，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，呈現(xiàn)修復(fù)期腦損傷改變，缺血+TAK組腦組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元形態(tài)趨于正常。缺血組和缺血+TAK組術(shù)后7 d損傷嚴(yán)重，缺血組和缺血+TAK組7 d時的腦梗死面積分別為15.46±0.522和4.05±0.643，缺血組明顯高于缺血＋TAK組 （P ＜ 0.01） 。

2.3 TLR4和P-IKK α/β在大腦皮質(zhì)的表達(dá)

Western blotting檢測TLR4 （圖3） 和P-IKK α/β （圖4）在大腦皮質(zhì)的表達(dá)。在所有時間點(diǎn)，假手術(shù)組TLR4的表達(dá)量最低；術(shù)后1和14 d，缺血＋TAK組TLR4的表達(dá)高于缺血組 （P ＜ 0.05） ；而術(shù)后3和7 d，缺血組TLR4的表達(dá)高于缺血＋TAK組 （P ＜ 0.05） 。術(shù)后1 d，缺血＋TAK組P-IKK α/β的表達(dá)高于假手術(shù)組和缺血組 （P ＜ 0.05） ，缺血組高于假手術(shù)組 （P ＜ 0.05） ；術(shù)后3、7和14 d，缺血組P-IKK α/β的表達(dá)高于假手術(shù)組和缺血＋TAK組 （P ＜ 0.05） 。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個多種機(jī)制參與的病理生理學(xué)過程，其中炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用［8］。ANDRESEN等［9］證實(shí)應(yīng)用TLR4單克隆抗體阻斷劑MTS510可改善缺血再灌注損傷小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能，減少腦梗死體積，減輕腦水腫。SONG等［10］的臨床研究也說明TLR4基因可能與湖南省漢族人群急性動脈粥樣硬化性腦梗死有關(guān)。

TLR4是Toll樣受體家族成員之一，通過髓樣分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88） 依賴通路和MyD88非依賴通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與腦缺血［11-12］。大量研究證實(shí)，TLR4在一系列酶的作用下可促使其下游激酶IKK α/β發(fā)生磷酸化，磷酸化后的IKK α/β與核因子κB調(diào)節(jié)蛋白在一系列酶的作用下促進(jìn)核因子κB抑制蛋白IκB磷酸化而降解，解除對核因子κB的抑制，進(jìn)而促使核因子κB從細(xì)胞質(zhì)移位入細(xì)胞核，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生［1，4］。TAK-242為TLR4拮抗劑，可特異性的與TLR4結(jié)合，拮抗TLR4的作用［4，6］。本研究采用TAK-242阻斷TLR4的作用，探討TLR4在大鼠腦缺血再灌注后不同時間點(diǎn)的作用及機(jī)制。

圖2 缺血組和缺血+TAK組大腦皮質(zhì)HE染色結(jié)果 ×400Fig.2 HE staining of cerebral cortices in the MCAO and MCAO+TAK groups ×400

本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后1 d，缺血+TAK組細(xì)胞水腫較缺血組嚴(yán)重，缺血+TAK組TLR4及P-IKK α/β的表達(dá)均高于缺血組，提示腦缺血再灌注后1 d TLR4可能減輕腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注后3、7和14 d，缺血+TAK組與缺血組相比大鼠神經(jīng)功能明顯改善，腦梗死面積也顯著減小，病理損傷減輕；P-IKK α/β的表達(dá)也低于缺血組，提示腹腔注射TAK-242有效抑制TLR4下游激酶IKK α/β的磷酸化，降低TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。有研究［13］報(bào)道在給予急性腦出血大鼠模型腹腔注射TAK-242后14 d，與未給藥組相比，TLR4表達(dá)增加。與本研究結(jié)果一致。因此，TLR4通過MyD88依賴通路參與腦缺血再灌注損傷，且在不同時間點(diǎn)作用不同。通過影響MyD88依賴通路下游調(diào)控因子P-IKK α/β的表達(dá)，在大鼠腦缺血再灌注損傷后1 d，TLR4可減輕腦缺血再灌注損傷，而在大鼠腦缺血再灌注損傷后3～14 d，可加重腦缺血再灌注損傷。TLR4參與腦缺血再灌注損傷在不同時間點(diǎn)的作用不同，考慮與炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注發(fā)生的不同時間釋放的促炎或抑炎因子不同相關(guān)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血再灌注發(fā)生的增殖反應(yīng)也隨著時間的推移而發(fā)生變化，OKUN等［14］報(bào)道TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可表達(dá)于神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等，其中在小膠質(zhì)細(xì)胞含量最高。而小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與免疫炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞。

圖4 各組大鼠不同時間點(diǎn)P-IKK α/β在大腦皮質(zhì)的表達(dá)Fig.4 P-IKK α/β expression at different time points in the cerebral cortices of the different group rats

綜上所述，TLR4通過MyD88依賴通路影響了P-IKK α/β在大腦皮質(zhì)的表達(dá)，參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，在大腦缺血再灌注早期可減輕腦缺血再灌注損傷，而后期加重腦缺血再灌注損傷。這一發(fā)現(xiàn)對以TLR4為靶點(diǎn)治療處于不同患病時期的缺血性腦卒中患者具有重要臨床指導(dǎo)意義。

［1］ ZHANG P，GUO ZF，XU YM，et al. N-Butylphthalide （NBP）ameliorated cerebral ischemia reperfusion-induced brain injury via HGF-regulated TLR4/NF-kappaB signaling pathway ［J］.Biomed Pharmacother，2016，83：658-666. DOI：10.1016/j.biopha.2016.07.040.

［2］ SIERRA A，ENCINAS JM，DEUDERO JJ，et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis ［J］. Cell Stem Cell，2010，7 （4） ：483-495. DOI：10.1016/j.stem.2010.08.014.

［3］ MEDZHITOV R，PRESTON-HURLBURT P，JANEWAY CA JR. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity ［J］. Nature，1997，388 （6640） ：394-397. DOI：10.1038/41131.

［4］ HUA F，TANG H，WANG J，et al. TAK-242，an antagonist for Tolllike receptor 4，protects against acute cerebral ischemia/reperfusion injury in mice ［J］. J Cereb Blood Flow Metab，2015，35 （4） ：536-542.DOI：10.1038/jcbfm.2014.240.

［5］ PUSHKOV D，NICHOLSON JD，MICHOWIZ S，et al. Relative neuroprotective effects hyperbaric oxygen treatment and TLR4 knockout in a mouse model of temporary middle cerebral artery occlusion ［J］. Int J Neurosci，2016，126 （2） ：174-181. DOI：10.3109/00207454.2014.1002609.

［6］ WANG Y，GE P，YANG L，et al. Protection of ischemic post conditioning against transient focal ischemia-induced brain damage is associated with inhibition of neuroinflammation via modulation of TLR2 and TLR4 pathways ［J］. J Neuroinflammation，2014，11：15.DOI：10.1186/1742-2094-11-15.

［7］ SHA T，SUNAMOTO M，KITAZAKI T，et al. Therapeutic effects of TAK-242，a novel selective Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor，in mouse endotoxin shock model［ J］. Eur J Pharmacol，2007，571（ 2/3） ：231-239. DOI：10.1016/j.ejphar.2007.06.027.

［8］ BURROWS F，HALEY MJ，SCOTT E，et al. Systemic inflammation affects reperfusion following transient cerebral ischemia［ J］. Exp Neurol，2016，277：252-260. DOI：10.1016/j.expneurol.2016.01.013.

［9］ ANDRESEN L，THEODOROU K，GRUNEWALD S，et al. Evaluation of the therapeutic potential of anti-TLR4-antibody MTS510 in experimental stroke and significance of different routes of application［ J］. PLoS One，2016，11（ 2） ：e0148428. DOI：10.1371/journal.pone.0148428.

［10］ SONG Y，LIU H，LONG L，et al. TLR4 rs1927911，but not TLR2 rs5743708，is associated with atherosclerotic cerebral infarction in the Southern Han population：a case-control study［ J］. Medicine，2015，94（ 2） ：e381. DOI：10.1097/MD.0000000000000381.

［11］ YANG Z，ZHONG L，ZHONG S，et al. miR-203 protects microglia mediated brain injury by regulating inflammatory responses via feedback to MyD88 in ischemia［ J］. Mol Immunol，2015，65（ 2） ：293-301. DOI：10.1016/j.molimm.2015.01.019.

［12］ HWANG EH，KIM TH，OH SM，et al. Toll/IL-1 domain-containing adaptor inducing IFN-beta （ TRIF） mediates innate immune responses in murine peritoneal mesothelial cells through TLR3 and TLR4 stimulation［ J］. Cytokine，2016，77：127-134. DOI：10.1016/j.cyto.2015.11.010.

［13］ LEI C，WU B，CAO T，et al. Brain recovery mediated by toll-like receptor 4 in rats after intracerebral hemorrhage［ J］. Brain Res，2016，1632：1-8. DOI：10.1016/j.brainres.2015.11.045.

［14］ OKUN E，GRIFFIOEN KJ，MATTSON MP. Toll-like receptor signaling in neural plasticity and disease［ J］. Trends Neurosci，2011，34（5） ：269-281. DOI：10.1016/j.tins.2011.02.005.