王思亓，李欣潞，林庚，王卓，3，程曉鳳，劉彤彤，4，鄭瑋

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)臨床一系，沈陽 110122； 2. 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽 110122； 3. 錦州醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院婦兒護理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001； 4. 遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110016）

阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD） 是一種起病隱匿的以進行性癡呆和情感障礙為主要臨床癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常發(fā)生于老年及老年前期。AD的主要病理改變包括大量β-淀粉樣蛋白 （amyloid beta，A β） 在細胞外沉積形成的老年斑，變性神經(jīng)元內(nèi)由Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及神經(jīng)元缺失和腦淀粉樣血管病變（cerebral amyloid angiopathy，CAA） 。研究［1-2］證實，鐵、銅和鋅等金屬離子與A β分泌、沉積和Tau蛋白磷酸化關(guān)系密切，因此以二價金屬離子及其轉(zhuǎn)運蛋白為切入點對AD發(fā)病機制進行研究是AD研究領(lǐng)域的熱點之一。

二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1 （divalent metal transporter 1，DMT1） 是維持細胞內(nèi)二價金屬離子穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)運蛋白，參與多種二價金屬離子的轉(zhuǎn)運。近年來，多項研究［3-6］證實在帕金森病患者和模型小鼠黑質(zhì)內(nèi)，DMT1表達增強，而自發(fā)突變導(dǎo)致的DMT1功能缺陷小鼠卻能拮抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶和6-羥基多巴誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元死亡等PD病理癥狀［4］，最新的研究［7］證實DMT1過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠不僅在黑質(zhì)區(qū)出現(xiàn)鐵聚集，腦內(nèi)Parkin蛋白的表達也顯著升高。本課題組前期研究［8］則首次證實DMT1在AD患者尸檢大腦皮層和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠大腦皮層及海馬老年斑內(nèi)異常分布且表達升高。

小腦在運動型學(xué)習記憶中具有重要作用，小腦與大腦、腦干以及脊髓之間存在發(fā)達的傳入、傳出聯(lián)系。研究［9-11］發(fā)現(xiàn)，晚期AD患者常出現(xiàn)小腦功能異常，浦肯野細胞核仁縮?。?2］、樹突減少［13］，小膠質(zhì)細胞增多［14］，以及A β老年斑沉積［11，15-16］。本研究組及其他科研團隊的研究［17-18］發(fā)現(xiàn)，多種鋅離子轉(zhuǎn)運蛋白 （zinc transporters，ZnTs） 在AD前期患者及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦中異常分布和表達，但目前尚無有關(guān)DMT1在AD小腦表達和變化的研究。因此，本研究擬通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙標染色及激光共聚焦掃描檢測DMT1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦內(nèi)的定位和分布，應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦內(nèi)DMT1蛋白表達水平的變化，為進一步探討二價金屬離子及其轉(zhuǎn)運體DMT1參與AD發(fā)病機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠 （購自美國Jackson Laboratory） 與同月齡野生C57BL/6小鼠各7只，分籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食。

1.1.2 主要試劑：DMT1兔多克隆抗體購自美國Alpha Diagnosis公司，A β小鼠單克隆抗體購自美國Sigma公司，GAPDH小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，F(xiàn)ITC標記的驢抗兔抗體、Texas Red標記的驢抗小鼠抗體、正常驢血清均購自美國Jackson Immuno Research Laboratory公司，SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購自中國博士德公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本制備：將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BL/6野生型小鼠斷頭處死后，迅速取出小腦，一側(cè)半球迅速放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色；另一側(cè)半球-80 ℃保存，用于Western blotting。

1.2.2 免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色：APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BL/6野生型小鼠的小腦組織石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、微波煮沸抗原修復(fù)后，用0.01 mol/L PBS充分沖洗。取用于A β免疫組織化學(xué)染色的標本，經(jīng)5% BSA室溫孵育1 h后，加入A β抗體 （1∶400） 4 ℃過夜，次日PBS充分漂洗后，加生物素—山羊抗小鼠IgG室溫2 h，0.05 mol/L Tris-HCl充分漂洗，SABC室溫1 h，DAB充分顯色后，大量蒸餾水充分沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。取用于DMT1/A β免疫熒光雙標染色的標本，經(jīng)正常驢血清 （1∶20）室溫孵育1 h后，加入兔源DMT1抗體 （1∶100） 和小鼠源A β抗體 （1∶400） 混合液室溫過夜，次日PBS充分漂洗后，加入FITC和Texas Red標記的熒光二抗混合液室溫2 h，PBS充分漂洗后，甩干，熒光封片劑封片，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察并采集圖像。

免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色的陰性對照：除使用正常血清代替一抗孵育小鼠小腦切片外，其他操作方法同上述免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色，均未檢測到明顯的陽性反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 Western blotting：用PBS充分清洗APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和C57BL/6野生型小鼠的小腦組織，分離皮層后稱質(zhì)量，按1∶5比例加入組織蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜。次日經(jīng)超速低溫離心 （12 000 g，4 ℃） 30 min后，小心抽取上清，考馬斯亮藍法測定組織蛋白量。10% SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白樣品后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉和0.05% Tween 20的TBS （TTBS） 封閉3 h，加入DMT1一抗 （1∶2 000） 和GAPDH一抗 （1∶10 000） 4 ℃孵育過夜。TTBS清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗 （1∶5 000） 室溫孵育2 h。TTBS清洗3次，每次10 min，滴加ECL發(fā)光液，用BIORAD凝膠電泳圖像分析儀采圖，Quantity One軟件包進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用Student t test方法進行數(shù)據(jù)分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腦內(nèi)A β陽性老年斑的分布

光鏡下，A β陽性免疫產(chǎn)物呈棕黃色，主要分布在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮層，呈大小不等的圓形、橢圓形或不規(guī)則形，中央有較致密的核心，邊界較清晰 （圖1B、1C） ，而野生型C57BL/6小鼠小腦皮質(zhì)中未檢測出A β陽性染色 （圖1A） 。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮層中，高倍鏡下可見A β陽性細胞分布于分子層和顆粒層中，還可見A β陽性毛細血管的分布（圖1C） 。

2.2 DMT1和A β在老年斑中的定位分布

圖1 A β免疫陽性斑塊在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮質(zhì)的分布Fig.1 Distribution of amyloid beta immunoreactivity plaques in the APP/PS1 transgenic mouse cerebellum

共聚焦激光掃描顯微鏡下，DMT1與A β免疫熒光雙標結(jié)果顯示，A β陽性的老年斑中均可見DMT1陽性染色，即DMT1和A β共定位于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮層老年斑內(nèi) （圖2） 。高倍鏡下顯示斑塊結(jié)構(gòu)清楚，A β在分子層和顆粒層斑塊內(nèi)均呈彌散分布，但斑塊中央部位的A β陽性反應(yīng)較弱，周邊部較強 （圖2F、2I） 。DMT1免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要集中在斑塊中央部位，周邊較弱 （圖2E、2H） ，與A β陽性分布存在共定位 （圖2D、2G） 。

2.3 DMT1表達的Western blotting分析

Western blotting結(jié)果顯示，DMT1蛋白在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮質(zhì)內(nèi)的表達水平明顯高于野生型對照小鼠，表達量是野生型對照小鼠的173.4%（P ＜ 0.01） （圖3） 。

3 討論

銅、鐵、鋅等二價金屬離子在神經(jīng)細胞的生理活動中具有重要作用，腦內(nèi)這些金屬離子的含量必須維持在特定范圍內(nèi)，如果穩(wěn)態(tài)失衡就可能引發(fā)疾病。研究［1，19-22］發(fā)現(xiàn)AD患者老年斑內(nèi)部及周圍均發(fā)現(xiàn)有銅、鋅和鐵富集；Tg2576小鼠腦內(nèi)A β陽性斑塊中也檢測到了高于正常水平的鐵和鋅［23-24］。大腦皮層和海馬是AD患者最容易受到病變損傷的腦區(qū)，在皮層和海馬老年斑中檢測到大量鋅、銅和鐵等金屬離子與A β共同沉積，本研究組的前期研究［8］也證實了DMT1在AD患者大腦皮層以及APP/PS1小鼠腦內(nèi)老年斑中有陽性表達，并與A β的分布相一致。小腦一直被認為受AD損傷的影響較小，然而，有研究［17］發(fā)現(xiàn)無癥狀臨床前期的AD患者小腦皮質(zhì)中可以檢測到鋅離子及鋅轉(zhuǎn)運蛋白 （zinc transporters，ZNTs） ZnT4和ZnT6分布和表達異常，本研究組之前也發(fā)現(xiàn)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦中存在鋅離子、ZnT3和ZnT6的分布與表達異常［18］。因而，本研究對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮質(zhì)中DMT1的表達和分布情況進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMT1蛋白表達水平增高，且DMT1與A β在小腦老年斑中存在共定位。上述的證據(jù)表明二價金屬離子及相關(guān)轉(zhuǎn)運體，尤其是DMT1，可能參與了AD小腦中A β的沉積。

圖2 DMT1在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮質(zhì)老年斑中的分布Fig.2 Localization of divalent metal transporter 1 in senile plaques in the cerebellum of APP/PS1 transgenic mouse

圖3 DMT1蛋白在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠小腦皮質(zhì)中的表達水平Fig.3 Western blotting analysis to check DMT1 protein levels in the cerebellar cortex of APP/PS1 transgenic mice

有研究［25-29］表明DMT1在腦內(nèi)的分布主要集中于中腦、皮層和海馬，有關(guān)小腦的分布的研究則較少。本研究中，Western blotting結(jié)果進一步證實APP/PS1小鼠小腦皮質(zhì)中DMT1蛋白水平較野生型對照組小鼠明顯增高，可能是由于DMT1蛋白在這些部位的老年斑中過度表達所致。CAA是AD的另一個重要的病理改變，有研究認為金屬離子與CAA的形成密切相關(guān)，在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)DMT1在淀粉樣變性的血管及其周圍呈陽性染色。根據(jù)本研究的上述實驗結(jié)果結(jié)合文獻分析，筆者推測介導(dǎo)二價金屬離子轉(zhuǎn)運的DMT1與小腦A β老年斑的形成密切相關(guān)，DMT1表達上調(diào)可以增強細胞跨膜轉(zhuǎn)運二價金屬離子的能力，使血液中大量金屬離子入腦并最終進入神經(jīng)元，引起神經(jīng)元內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡，進而通過氧化應(yīng)激反應(yīng)和Fenton反應(yīng)等引起自由基增多，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性、功能異常，甚至死亡。

DMT1在小腦皮質(zhì)內(nèi)異常分布和表達究竟是AD發(fā)生的某一始動因素，還是AD進展過程中的某種異常結(jié)局，現(xiàn)在還未可知，而且腦內(nèi)參與金屬離子跨細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)運蛋白還有很多，它們之間存在著既協(xié)同又拮抗的作用，因而DMT1的異常分布和表達可能有著更復(fù)雜的含義，還需要更加細致和深入的研究。

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