寧宏宇，江 濤，張 瑞，何 羽，姚文兵，田 浤*

(中國藥科大學(xué) 1江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室;2生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,南京 210009)

免疫原性氨基酸是指能提高蛋白質(zhì)免疫原性的一類氨基酸，如硝基酪氨酸、對硝基苯丙氨酸等。在自體蛋白中引入免疫原性氨基酸能誘使機體突破免疫耐受，產(chǎn)生針對自體蛋白的特異性抗體[1]。Hardy等[2]用化學(xué)合成的方法將抗原表位肽中的酪氨酸置換成硝基酪氨酸，證實了僅在一個位點引入免疫原性氨基酸即可明顯影響MHC I類限制性抗原表位的識別。另有文獻報道，將對硝基苯丙氨酸定點引入至小鼠的腫瘤壞死因子(TNF-α)中，免疫小鼠后產(chǎn)生了能夠與原TNF-α發(fā)生交叉反應(yīng)的中和抗體。利用此方法，對小鼠進行LPS過度刺激，突變蛋白免疫后的小鼠能夠存活，證明抗體的存在能夠有效地控制小鼠體內(nèi)TNF-α的含量[1,3-4]。

盡管免疫原性氨基酸突破自身免疫耐受的作用已被研究證實，但其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體的作用機制尚不完全清楚。前期研究已證實，免疫原性氨基酸并非通過形成新的B細胞表位誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的抗體能與未引入非天然氨基酸的原型蛋白產(chǎn)生廣泛的交叉反應(yīng)[5-7]。因此推測，免疫原性氨基酸可能是通過影響T細胞而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生自身抗體。

本課題組前期以人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)為模型分子，制備了一系列含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體[8-10]。本研究利用含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體免疫小鼠后，對小鼠CD4+T細胞的不同亞群比例及Bcl-6、FOXP3等主要轉(zhuǎn)錄因子進行了分析，以探討對硝基苯丙氨酸在蛋白質(zhì)中的定點引入對T細胞亞群分化的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，HRP偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(南京鼎國公司);鄰苯二胺(OPD)，小鼠脾臟淋巴細胞、分離液(天津市灝洋公司)；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清(美國Gibco公司)；鋁佐劑、PMA和離子霉素(美國Sigma公司)；BFA，Staining buffer，流式固定破膜液以及流式抗體等(美國BD公司)；RNA提取試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒、qPCR試劑盒(北京全式金公司)；引物合成(南京金斯瑞公司)；小鼠IL-21 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

ELISA酶標條，細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；全波長酶標儀(美國Thermo公司)；FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD公司)；LightCycler96實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.3 動 物

BALB/c小鼠，6～8周齡，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號：No.201713517。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 HER2突變體的表達與純化

實驗室前期分別將編碼HER2蛋白的5號，26號和79號位氨基酸的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子TAG，并將3種突變體基因引入質(zhì)粒pET28a，命名為pET28a-5TAG-HER2質(zhì)粒，pET28a-26TAG-HER2質(zhì)粒，pET28a-79TAG-HER2質(zhì)粒，將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，構(gòu)建為3種重組菌，將3種重組菌分別培養(yǎng)8 h后，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)進行誘導(dǎo)，同時加入對硝基苯丙氨酸(終濃度100 mmol/L)，37 ℃，220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)18 h，離心收取菌體沉淀。將菌體按10 mL/g的比例加入0.10 mol/L NaCl緩沖液中重懸，超聲破碎，離心收集包涵體沉淀。每克包涵體沉淀加入含20 mmol/L咪唑的包涵體變性液10 mL，重懸并在4 ℃變性過夜，完全溶解后將變性液過Ni親和色譜柱，用濃度梯度為20～500 mmol/L的咪唑緩沖液梯度洗脫，檢測合并含目的蛋白的洗脫液，按體積比1∶4的比例加入復(fù)性緩沖液，用PBS(pH 8.0)緩沖液透析，超濾濃縮，加入等體積甘油混合均勻，分別命名為5-HER2，26-HER2和79-HER2，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HER2突變體免疫原性分析

將6～8周齡C57BL/6雌性小鼠隨機分為8組，每組6只，分別為PBS組、佐劑組、WT-HER2(原型HER2)組、WT-HER2加佐劑組、5-HER2組、26-HER2組、79-HER2組、79-HER2加佐劑組。分別于實驗的第1天和第8天。PBS組注射PBS溶液150 μL，WT-HER2、5-HER2、26-HER2、79-HER2組分別注射WT-HER2、5-HER2、26-HER2和79-HER2；WT-HER2加佐劑組和79-HER2加佐劑組分別注射WT-HER2和79-HER2與鋁佐劑按體積比1∶1混合的混合溶液，蛋白劑量均為1 μg/g。免疫后每周取血，分離血清，共取5周。利用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗HER2抗體含量，用WT-HER2蛋白包被酶標條，加入各組小鼠血清孵育2 h，PBST清洗后加入HRP偶聯(lián)羊抗鼠IgG孵育1 h，清洗后加入反應(yīng)底物，反應(yīng)30 min 后加入終止液，用酶標儀在492 nm處測定吸收度。

2.3 免疫后小鼠淋巴結(jié)Th細胞亞群分析

2.3.1 小鼠淋巴結(jié)淋巴細胞的分離 取免疫后小鼠的淋巴結(jié)，分別研磨過70 μm篩網(wǎng)，用PBS沖洗收集至15 mL離心管中，離心收集細胞，用PBS 1 mL重懸，在新的15 mL離心管中加入小鼠脾臟淋巴細胞分離液3 mL，傾斜離心管，沿離心管壁緩慢加入細胞懸液，保持液面清晰，2 000 r/min室溫離心20 min，用巴斯德吸管吸取乳白色云霧狀的淋巴細胞層至一個新的15 mL離心管中，加入10倍體積的PBS洗滌細胞2次，用PBS 1 mL重懸淋巴細胞，計數(shù)。

2.3.2 Th細胞亞群檢測 Th1細胞用CD4/IFN-γ標記，Th2細胞用CD4/IL-4標記，Tfh細胞用CD4/CXCR5/ICOS標記，Treg細胞用CD4/FOXP3標記。

用于標記Th1/Th2的細胞預(yù)先用RPMI1640培養(yǎng)基(10%FBS)重懸，鋪于6孔板中，加入20 ng/mL PMA，1 μg/mL離子霉素以及1 μL/mL GolgiStop(均用終濃度表示)孵育6 h，收集離心，計數(shù)。

染色方法如下：取1×106個淋巴細胞至2 mL EP管中，2 000 r/min離心棄上清液，加入anti-CD4(Th1/Th2/Treg)或anti-CD4/anti-CXCR5/anti-ICOS(Tfh)染色工作液20 μL，4 ℃避光孵育30 min，用PBS清洗2次，Th1/Th2/Treg細胞另加入Cytofix/Cytoperm緩沖液250 μL重懸細胞沉淀，4 ℃避光孵育20 min，Perm/Wash緩沖液洗滌細胞2次，加入anti-IFN-γ(Th1)/anti-IL-4(Th2)/anti-FOXP3(Treg)染色工作液20 μL，4 ℃暗處孵育30 min，Perm/Wash緩沖液清洗2次。上流式細胞儀檢測。

2.4 小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平分析

用實時熒光定量PCR法檢測小鼠淋巴結(jié)中Bcl-6和FOXP3的表達。按照試劑盒說明，提取淋巴結(jié)總RNA，以隨機引物合成cDNA的第一條鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板，以SYB GREEN標記熒光定量，檢測β-actin，Bcl-6及FOXP3基因表達情況。PCR引物序列如下：β-actin上游引物5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，β-actin下游引物5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′；Bcl-6上游引物5′-CACACCCGTCCATCATTGAA-3′，Bcl-6下游引物5′-TGTCCTCACGGTGCCTTTTT-3′；FOXP3上游引物5′-CTATGCCACCCTTATCCGA-3′，F(xiàn)OXP3下游引物5′-TCCTCTTCTTGCGAAACTCA-3′。

反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s(熒光檢測)，40個循環(huán)。PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集于LightCycler96系統(tǒng)上進行，記錄其循環(huán)閾值(Ct)。采用ΔΔCt法，以β-actin為內(nèi)參，相對定量各實驗組樣品內(nèi)目的基因的表達水平。

2.5 免疫后小鼠血清中IL-21含量分析

根據(jù)試劑盒說明書，采用雙抗夾心ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-21的含量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 含對硝基苯丙氨酸的HER2蛋白的表達與純化

以79-HER2工程菌為例，工程菌培養(yǎng)8 h后，加入IPTG與對硝基苯丙氨酸進行誘導(dǎo)表達，采樣進行全菌電泳，如實驗結(jié)果(圖1-A)所示，誘導(dǎo)后在14 kD附近出現(xiàn)了目的條帶，與理論相對分子質(zhì)量相符。經(jīng)超聲破碎、變性、Ni柱純化、透析、超濾等步驟，獲得了電泳純的目的蛋白(圖1-B)。

Figure1 SDS-PAGE analysis of protein expression of the bacteria containing pET28a-79TAG-HER2 plasmid

(A) M:Protein marker;1:Total cell proteins of the reorganized strains before induction with pNO2Phe;2:Total cell proteins of the reorganized strains after induction without pNO2Phe;3:Total cell proteins of the reorganized strains after induction with pNO2Phe.

(B) M:Protein marker;1:Purified 79-pNO2Phe-HER2

3.2 含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體的免疫原性分析

對小鼠采取眼眶取血，離心后收集上層血清，用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗WT-HER2抗體的效價，免疫后持續(xù)檢測5周(圖2)。免疫后，3種突變體HER2免疫的小鼠血清中抗HER2抗體滴度均隨著時間而增加，而WT-HER2，PBS和佐劑免疫的小鼠血清中則沒有檢測到抗HER2抗體的分泌。在第5周時，WT-HER2免疫的小鼠血清中抗體效價仍維持在較低水平，與PBS組不存在顯著性差異(P>0.05)。而5-HER2，26-HER2和79-HER2均能不同程度刺激小鼠產(chǎn)生抗HER2抗體，均與PBS組有極顯著差異(P<0.001)。

A：Serum titer of anti-WT-HER2 antibody from week 1-5；B：Serum titer of anti-WT-HER2 antibody of mice vaccinated with PBS,WT-HER2 and 79-HER2 on week 5

***P<0.001;ns:P>0.05

3.3 免疫后小鼠Th細胞亞群比例的分析

從小鼠淋巴結(jié)中采用密度梯度離心法分離淋巴細胞，流式染色后檢測Th細胞亞群的比例。實驗結(jié)果(圖3)表明，WT-HER2和79-HER2免疫小鼠后，均不能使小鼠淋巴結(jié)中Th1和Th2的比例發(fā)生變化(P>0.05)，而79-HER2免疫后，能使小鼠淋巴結(jié)中的Tfh細胞比例(8.74±1.99)%明顯上升，與PBS組(4.60±0.772)%和原型組(3.79±0.68)%均存在極顯著差異(P<0.001)。79-HER2免疫后，能使小鼠淋巴結(jié)中Treg細胞比例(1.11±0.67)%下降，與PBS組(4.89±1.33)%存在顯著性差異(P<0.05)，而WT-HER2免疫小鼠后，淋巴結(jié)Treg細胞的比例(2.88±0.86)%與PBS組不存在顯著性差異(P>0.05)。

3.4 免疫后小鼠T細胞中Bcl-6和FOXP3轉(zhuǎn)錄水平的變化

提取各實驗組總RNA后，用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后以此為模板，采用實時熒光定量PCR法，進一步考察了小鼠淋巴結(jié)中Tfh細胞和Treg細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和FOXP3的基因表達水平變化。研究表明(圖4)，79-HER2免疫小鼠后，小鼠淋巴結(jié)Bcl-6 mRNA水平相對PBS組和WT-HER2組均有顯著升高(P<0.001)，而WT-HER2免疫小鼠后Bcl-6 mRNA水平相對PBS組則沒有顯著改變(P>0.05)。且79-HER2免疫后，能使小鼠淋巴結(jié)中FOXP3 mRNA表達相對PBS組(P<0.01)和WT-HER2組(P<0.05)均有顯著下降，而WT-HER2免疫小鼠則不能使FOXP3表達相對PBS組發(fā)生變化(P>0.05)，實驗結(jié)果與流式結(jié)果基本一致。

3.5 免疫后小鼠血清中IL-21含量的變化

Tfh細胞是生發(fā)中心形成和B細胞成熟過程中的關(guān)鍵輔助性T細胞，而IL-21是Tfh細胞的主要效應(yīng)細胞因子。免疫5周后，檢測各組小鼠血清中的IL-21含量，結(jié)果如圖5所示，與PBS組[(2.76±1.84) pg/mL]和WT-HER2組[(4.58±2.33) pg/mL]相比，79-HER2免疫小鼠后，小鼠血清中的IL-21 含量[(28.49±14.54) pg/mL]有顯著升高(P<0.05)。

Figure3 79-HER2 induce the differentiation of T lymphocyte

**P<0.01;***P<0.001;ns:P>0.05

Figure4 mRNA abundance of Bcl-6 and FOXP3

**P<0.01;***P<0.001;*P<0.05; ns:P>0.05

*P<0.05;ns:P>0.05

4 討 論

免疫原性氨基酸的引入能顯著提高蛋白質(zhì)的免疫原性，使機體產(chǎn)生特異性抗體，但其誘導(dǎo)特異性抗體的機制及其對機體T細胞亞群分化的影響尚不明確。本研究表達了定點引入對硝基苯丙氨酸的HER2突變體。用含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體免疫小鼠，分析其對小鼠T細胞亞群分化的影響。結(jié)果表明突變體HER2免疫能提高小鼠淋巴結(jié)中Tfh細胞的比例，同時使Treg細胞的比例下降，而對Th1和Th2細胞比例無明顯影響。

Tfh細胞是生發(fā)中心的形成與其發(fā)揮功能的過程中的關(guān)鍵輔助細胞，以高表達CXC趨化因子受體5(CXCR5)為特征，CXCR5能引導(dǎo)Tfh細胞向濾泡中高表達CXCL13的B細胞區(qū)遷移[11-12]，Tfh同時共表達ICOS，PD-1，細胞因子IL-21和Bcl-6[13-16]。Tfh細胞在B細胞成熟和其類型轉(zhuǎn)換和特異性成熟過程中起著關(guān)鍵作用，Tfh細胞選擇性的向能分泌高親和力、高特異性抗體的B細胞提供存活，增殖或分化信號[17]，并使其發(fā)生體細胞突變，為BCR的突變多樣性提供了基礎(chǔ)。由抗原接觸活化的B細胞在Tfh細胞的輔助下由趨化因子和趨化因子樣介質(zhì)引導(dǎo)，遷移通過次級淋巴組織的多個區(qū)室，進入生發(fā)中心，在其中發(fā)生體細胞突變與親和力成熟，最終分化為能分泌高親和力與特異性抗體的漿細胞[18-19]。

本研究檢測了CD4+CXCR5+ICOS+的Tfh細胞在淋巴結(jié)T細胞中的比例變化，結(jié)果顯示突變體HER2免疫后Tfh細胞比例顯著上升，且ICOS+細胞的比例無明顯變化，而CXCR5+細胞的比例有所上升。由于CXCR5通過識別CXCL13，將T、B細胞引導(dǎo)至B細胞濾泡，并使T細胞激活B細胞，而ICOS作為B7家族的共刺激分子，通過與其配體ICOSL結(jié)合，能刺激T細胞的活化和增殖，因此對硝基苯丙氨酸可能通過上調(diào)CXCR5的表達，從而增加歸巢至濾泡的Tfh細胞數(shù)量，從而促進漿細胞的分化，最終使機體分泌抗HER2抗體。

本研究驗證了對硝基苯丙氨酸增加蛋白質(zhì)免疫原性的作用，證實了含對硝基苯丙氨酸的HER2蛋白免疫能使小鼠淋巴結(jié)Tfh細胞比例上調(diào)，并使Treg細胞比例下降，但由于Tfh細胞在抗原刺激下分泌的IL-21,IL-4,CXCL13和CD40L等標志物在非特異性刺激下也會發(fā)生表達的提高，抗原特異性Tfh細胞的測定是十分困難的[20]，因此，這些上調(diào)的Tfh細胞是否為HER2特異性Tfh細胞仍需進一步研究。

[1] Gruenewald J,Tsao ML,Perera R,etal.Immunochemical termination of self-tolerance[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(32):11276-11280.

[2] Hardy LL,Wick DA,Webb JR.Conversion of tyrosine to the inflammation-associated analog 3′-nitrotyrosine at either TCR-or MHC-contact positions can profoundly affect recognition of the MHC class I-restricted epitope of lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein 33 by CD8 T cells[J].JImmunol,2008,180(9):5956-5962.

[3] Xie J,Schultz PG.An expanding genetic code[J].Methods,2005,36(3):227-238.

[4] Kessel C,Nandakumar KS,Peters FB,etal.A single functional group substitution in C5a breaks B cell and T cell tolerance and protects against experimental arthritis[J].ArthritisRheumatol,2014,66(3):610-621.

[5] Hallam TJ,Wold E,Wahl A,etal.Antibody conjugates with unnatural amino acids[J].MolPharm,2015,12(6):1848-1862.

[6] Grunewald J,Hunt GS,Dong L,etal.Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids[J].ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(11):4337-4342.

[7] Gauba V,Grunewald J,Gorney V,etal.Loss of CD4 T-cell-dependent tolerance to proteins with modified amino acids[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(31):12821-12826.

[8] Zhang TJ,Tian H,Gao XD.Advances in research on antitumor activities of HER2-based peptide vaccines[J].ProgPharmSci(藥學(xué)進展),2013,37(10):516-521.

[9] Zhang R,Tian H,Gao XD,etal.Application of next generation genome editing technology in gene therapy and biopharmaceuticals[J].JChinaPharmUniv(中國藥科大學(xué)學(xué)報),2014,45(4):504-510.

[10] Yao DN,Xu XW,Yu HB,etal.Screening system for amber suppressor tRNA based on inducible high-copynumber plasmid[J].JChinaPharmUniv(中國藥科大學(xué)學(xué)報),2013,44(2):174-178.

[11] Chen X,Ma W,Zhang T,etal.Phenotypic Tfh development promoted by CXCR5-controlled re-localization and IL-6 from radiation-resistant cells[J].ProteinCell,2015,6(11):825-832.

[12] Moser B.CXCR5,the defining marker for follicular B helper T (T-FH) cells[J].FrontImmunol,2015,6:296.

[13] Mcguire HM,Vogelzang A,Warren J,etal.IL-21 and IL-4 collaborate to shape T-dependent antibody responses[J].JImmunol,2015,195(11):5123-5135.

[14] Choi YS,Yang JA,Yusuf I,etal.Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory[J].JImmunol,2013,190(8):4014-4026.

[15] Liu X,Yan X,Zhong B,etal.Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell programinvivo[J].JExpMed,2012,209(10):1841-1852.

[16] Ozaki K,Spolski R,Ettinger R,etal.Regulation of B cell differentiation and plasma cell generation by IL-21,a novel inducer of Blimp-1 and Bcl-61[J].JImmunol,2004,173(9):5361-5371.

[17] Crotty S.A brief history of T cell help to B cells[J].NatRevImmunol,2015,15(3):185-189.

[18] Toellner KM.Cognate interactions:extrafollicular IL-4 drives germinal-center reactions,a new role for an old cytokine[J].EurJImmunol,2014,44(7):1917-1920.

[19] Zhang Y,Garcia-Ibanez L,Toellner KM.Regulation of germinal center B-cell differentiation[J].ImmunolRev,2016,270(1):8-19.

[20] Dan JM,Arlehamn CSL,Weiskopf D,etal.A cytokine-independent approach to identify antigen-specific human germinal center T follicular helper cells and rare antigen-specific CD4(+) T cells in blood[J].JImmunol,2016,197(3):983-993.