沈丹丹 ，曾 杰 ，梁涵雁 ，姜學美 ，蔣 晨

（1.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121； 2.重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121； 3.福安藥業(yè)＜集團＞股份有限公司，重慶 401121）

鹽酸黃酮哌酯為第2代尿失禁治療藥物，具有抑制腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶及拮抗鈣離子作用，并有弱抗毒蕈堿作用，對泌尿生殖系統(tǒng)的平滑肌具有選擇性解痙作用，臨床主要用于治療各種尿路疾病引起的尿頻、尿急、尿痛、排尿困難及尿失禁等癥[1-7]。國內(nèi)鹽酸黃酮哌酯原料有6家企業(yè)生產(chǎn)，但現(xiàn)在市場供應的原料只有2家企業(yè)生產(chǎn)。目前，國內(nèi)鹽酸黃酮哌酯有片劑和膠囊劑，有 0.1 g和 0.2 g 2個規(guī)格，其中片劑有 10家生產(chǎn)企業(yè)，膠囊劑有2家生產(chǎn)企業(yè)。本次國家藥品抽樣評價共抽取樣品107批，全部為片劑，涉及生產(chǎn)企業(yè)6家，未抽到膠囊劑。

鹽酸黃酮哌酯原料、片劑和膠囊劑的現(xiàn)行質(zhì)量標準均為2015年版《中國藥典（二部）》[8]，其有關(guān)物質(zhì)檢查方法均為薄層色譜（TLC）法，曾有報道采用高效液相色譜(HPLC)法測定鹽酸黃酮哌酯含量[9]，但目前國內(nèi)尚無鹽酸黃酮哌酯有關(guān)物質(zhì)測定方法的研究報道。國內(nèi)上市的鹽酸黃酮哌酯原料和制劑有關(guān)物質(zhì)執(zhí)行標準均為現(xiàn)行藥典標準，采用薄層色譜(TLC)法。該方法為半量法，操作比較煩瑣，方法靈敏度較低，人為判斷較主觀，且僅控制雜質(zhì)3-甲基黃酮-8-羧酸。107批樣品按照現(xiàn)行質(zhì)量標準檢驗，僅有30批樣品檢出已知雜質(zhì)A（3-甲基黃酮-8-羧酸），僅1批樣品檢出未知雜質(zhì)，說明現(xiàn)行藥典有關(guān)物質(zhì)測定方法專屬性和靈敏度均較差，檢查結(jié)果不能反映藥品中雜質(zhì)的真實含量。美國藥典（USP39）[10]、英國藥典（BP2016）[11]收載的鹽酸黃酮哌酯原料有關(guān)物質(zhì)檢查方法均為HPLC法，但色譜條件和雜質(zhì)限度不相同；鹽酸黃酮哌酯片有關(guān)物質(zhì)USP39采用HPLC法，BP2016為TLC法。USP39收載的原料雜質(zhì)譜包括3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質(zhì)A）、3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯（雜質(zhì) B）、3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯（雜質(zhì)C），BP2016收載的原料雜質(zhì)譜包括3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質(zhì)A）、3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯（雜質(zhì)B）、3-甲基黃酮-8-羧酸異丙酯（雜質(zhì)C），因此考慮結(jié)合USP39及BP2016的雜質(zhì)譜。本研究中建立了同時測定 3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質(zhì) A）、3-甲基黃酮 -8-羧酸甲酯（雜質(zhì)B）、3-甲基黃酮 -8-羧酸乙酯（雜質(zhì)C）及3-甲基黃酮-8-羧酸異丙酯（雜質(zhì)D）的HPLC法，并制訂合理的質(zhì)控指標，供現(xiàn)行藥典質(zhì)量標準提高參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters e2695型高效液相色譜儀，包括Waters 2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；K51502653型電子天平（德國賽多利斯公司）。

試藥：鹽酸黃酮哌酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100964-200701，含量為100.0%）；雜質(zhì)A（3-甲基黃酮-8-羧酸）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100965-200701，含量為100.0%）；雜質(zhì) B（3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯）對照品（USP，批號為1.0，含量 100.0% ）；雜質(zhì) C（3- 甲基黃酮 -8- 羧酸乙酯）對照品（BP，批號為 156.02.08.01，含量為 99.9% ）；雜質(zhì) D（3-甲基黃酮 -8-羧酸異丙酯）對照品（BP，批號為2417，含量為99.4%）。鹽酸黃酮哌酯片，A廠(批號為 20150602），B 廠(批號為 150504），C 廠(批號為20160304），D 廠 (批號為 20150501），E 廠 (批號為03A160207），F(xiàn) 廠(批號為 20150701），規(guī)格均為每片0.2 g；鹽酸黃酮哌酯原料，F(xiàn) 廠(批號為 20160502），G廠(批號為FA160142）。己烷磺酸鈉（白賽勤化學技術(shù)有限公司，批號為20161125），三乙胺（成都市科龍化工試劑廠，批號為20161011），磷酸（重慶川東化工有限公司，批號為20170601），均為分析純；乙腈（安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司，批號為6308IS317）為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Phenomenex Luna C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm），十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：緩沖液（取1 g己烷磺酸鈉，加水適量使溶解，加三乙胺1 mL和磷酸 1 mL，加水稀釋至 650 mL，搖勻）-乙腈（65∶35）等度洗脫1 min，待第1個色譜峰（鹽酸黃酮哌酯峰）洗脫完畢后，線性梯度洗脫(見表1)；檢測波長：293 nm；流速：1.0 mL ／min；進樣量：20 μL。取混合對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，先以流動相等度洗脫，待第1個色譜峰（鹽酸黃酮哌酯峰）洗脫完畢，按表1進行線性梯度洗脫。鹽酸黃酮哌酯、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì) C、雜質(zhì)D依次出峰，各峰間分離度均符合規(guī)定，色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取本品細粉適量（約相當于鹽酸黃酮哌酯100 mg），置100 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取鹽酸黃酮哌酯對照品、雜質(zhì)A對照品、雜質(zhì)B對照品、雜質(zhì)C對照品、雜質(zhì)D對照品各約10 mg，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品貯備液；精密量取鹽酸黃酮哌酯對照品貯備液1.0 mL，雜質(zhì) A、雜質(zhì) B、雜質(zhì)C及雜質(zhì) D貯備液各3.0 mL，置100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.3 專屬性試驗

按照各個廠家處方配制混合輔料，精密量取輔料適量，依法配制成輔料溶液，精密量取續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在此條件下，空白溶劑、空白輔料均不干擾有關(guān)物質(zhì)的測試，方法專屬性良好(見圖 2)。

2.4 破壞性試驗

光照破壞：取紫外光(254 nm)下照24 h的鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加溶劑使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

氧化破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加30%過氧化氫5 mL，放置5 min，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

酸破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加 1.0 mol／L 鹽酸 1 mL，放置 10 min，分別加1.0 mol／L氫氧化鈉1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

堿破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料25 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加 1.0 mol／L 氫氧化鈉 1 mL，放置10 min，分別加 1.0 mol／L 鹽酸 1 mL，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖

高溫破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料適量，分別置烘箱中60℃條件下放置24 h，取出放至室溫，精密稱定25 mg，置25 mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

高濕破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料適量，分別在溫度為25℃、相對濕度為92.5%條件下放置10 d，取出，放至室溫。取本品各約25 mg，置25 mL容量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

未破壞：取鹽酸黃酮哌酯原料適量，依法制備供試品溶液。

精密量取上述供試品續(xù)濾液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖3)。按峰面積歸一化法計算雜質(zhì)含量，結(jié)果見表2。與未破壞樣品雜質(zhì)含量比較，結(jié)果F廠和G廠家的原料對堿均不穩(wěn)定。其中，F(xiàn)廠原料堿破壞條件下雜質(zhì)A含量（58.60%）顯著性增加，G廠原料在強堿條件下雜質(zhì)A含量（2.10%）也增加，表明在強堿條件下容易降解產(chǎn)生雜質(zhì)A。其他條件下雜質(zhì)含量基本無變化，表明供試品溶液對光、高溫、高濕、酸及氧均比較穩(wěn)定。

2.5 線性關(guān)系考察

稱取鹽酸黃酮哌酯對照品10.81 mg，雜質(zhì)A對照品 9.74 mg，雜質(zhì) B 對照品 10.21 mg，雜質(zhì) C 對照品10.30 mg，雜質(zhì) D 10.77 mg，精密稱定，分別置 100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為對照品貯備液。精密量取鹽酸黃酮哌酯對照品貯備液1.0 mL，雜質(zhì) A，B，C，D 貯備液各 0.30，0.75，1.50，3.00，4.50，6.00 mL，分別置100 mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。取混合對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程。結(jié)果見表3。

2.6 各雜質(zhì)的校正因子計算

根據(jù)各雜質(zhì)和鹽酸黃酮哌酯線性試驗中線性曲線斜率，計算各雜質(zhì)與鹽酸黃酮哌酯的曲線斜率之比即為校正因子。結(jié)果見表 3?？梢?，雜質(zhì) A，B，C，D校正因子均不在0.90～1.10范圍內(nèi)，故不能采用自身對照法測定雜質(zhì)含量。

圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖

2.7 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液20 μL，平行6次，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見表3。可見，儀器精密度良好。

表2 F廠和G廠原料破壞性試驗結(jié)果（%）

表3 方法學考察試驗結(jié)果

2.8 加樣回收試驗

取本品內(nèi)容物細粉適量（約相當于鹽酸黃酮哌酯100 mg），精密稱定，平行12份，分別置100 mL容量瓶中。分別精密加入雜質(zhì) A，B，C，D 質(zhì)量濃度為 100 μg／mL的對照品溶液 0.3，3.0，6.0 mL，各 3 份，用流動相稀釋至刻度，搖勻，使各雜質(zhì)質(zhì)量濃度約相當于供試品溶液測定質(zhì)量濃度的 0.03% ，0.30% ，0.60% ；最后 2 份用流動相稀釋至刻度，搖勻；將上述各溶液超聲10 min，放冷，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密量取雜質(zhì)A，B，C，D對照品適量，用流動相溶解并稀釋成每1 mL中含3 μg的混合溶液作為對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法分別計算每份供試品中各雜質(zhì)的總量，計算回收率。結(jié)果見表3。

2.9 定量限與檢測限測定

精密量取2.5項下混合對照品溶液適量，用溶劑逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度，吸取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比（S／N）3∶1計算各成分的檢測限，以信噪比（S／N）10∶1計算定量限。結(jié)果見表 3。

2.1 0 穩(wěn)定性試驗

取鹽酸黃酮哌酯片（F廠，批號為20160102）適量，研細，按 2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，1，2，3，4，6，8，12，16，20 h 時吸取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各已知雜質(zhì)、其他單個最大雜質(zhì)、其他總雜質(zhì)峰面積的 RSD，以評價溶液的穩(wěn)定性。雜質(zhì)A在20 h內(nèi)峰面積的 RSD為2.9%，說明雜質(zhì)A不穩(wěn)定（在6 h內(nèi)的 RSD為0.4%，說明雜質(zhì)A在6 h內(nèi)穩(wěn)定）；雜質(zhì)B及雜質(zhì)C在20 h內(nèi)的 RSD分別為1.6%和0.9%，低于2.0%；雜質(zhì)D未檢出；其他單個最大雜質(zhì)在20 h內(nèi)的 RSD為0.6%；總雜質(zhì)在6 h內(nèi)的 RSD為0.2%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.1 1 耐用性試驗

色譜柱：色譜柱選用 Phenomenex Gemini C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），Phenomenex Luna C18柱（150mm ×4.6mm，5μm），資生堂Spolar C18柱（150mm ×4.6 mm，5 μm）及島津 Inertsil ODS-C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm），其他條件保持不變，精密量取 2.1 項下系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果不同種類的色譜柱對分離度無明顯影響，本方法對色譜柱的種類耐用性強。

柱溫：將柱溫分別設定為25，30，35℃，其他條件保持不變，精密量取 2.1項下系統(tǒng)適用性溶液 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果柱溫在25～35℃變化范圍內(nèi)，分離度均大于2.0，表明方法對柱溫耐用性強。

流速：將流速分別設定為 0.8，1.0，1.2 mL ／min，其他條件保持不變，精密量取2.1項下系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果流速在0.8～1.2 mL ／min 變化范圍內(nèi)，分離度均大于 2.0，表明方法對流速耐用性強。

2.1 2 樣品含量測定

取6個廠家樣品，研細，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密量取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算雜質(zhì)含量。結(jié)果見表4。

表4 各廠家樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（%）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

鹽酸黃酮哌酯極性較強，容易被洗脫，但雜質(zhì)A，C，D極性較弱，不容易被洗脫。按照英國藥典及美國藥典原料測定色譜條件，結(jié)果輔料對雜質(zhì)A測定有干擾。按照美國藥典片劑測定條件，輔料對雜質(zhì)測定無干擾，但由于美國藥典未收載雜質(zhì)D，因此在該色譜條件下雜質(zhì)D很難被洗脫，保留時間約102 min。因此，參照美國藥典片劑色譜條件進行優(yōu)化，采用了先等度洗脫鹽酸黃酮哌酯，再升高乙腈比例洗脫極性較弱的雜質(zhì)，從而縮短了雜質(zhì)保留時間并達到有效分離。USP 39原料和片劑分別采用240 nm及293 nm作為檢測波長，本研究中采用雙波長240 nm及293 nm同時檢測供試品中各雜質(zhì)量及雜質(zhì)個數(shù)，表明各雜質(zhì)在這2個波長下響應基本一致，但293 nm基線更平穩(wěn)，因此選擇293 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測波長。鹽酸黃酮哌酯片6個生產(chǎn)企業(yè)處方采用的輔料種類較多，各不相同，所選流動相可避免輔料干擾，同時保證主峰與各雜質(zhì)峰分離度達到要求。

3.2 破壞試驗

國內(nèi)主要原料供應商均采用以3-甲基黃酮-8-羧酸為起始原料的合成工藝，該合成路線的主要雜質(zhì)為3-甲基黃酮-8-羧酸、3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯、3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯。3-甲基黃酮-8-羧酸既是起始原料，也是主要降解產(chǎn)物，同時也是體內(nèi)降解主要產(chǎn)物。因此，其是鹽酸黃酮哌酯的關(guān)鍵雜質(zhì)，另外，3個雜質(zhì)是由3-甲基黃酮-8-羧酸與甲醇或乙醇或異丙醇成酯產(chǎn)生，可能在原料精制工序與精制溶劑發(fā)生反應產(chǎn)生，也可能在制劑過程中與溶劑反應產(chǎn)生。鹽酸黃酮哌酯性質(zhì)較穩(wěn)定，原料在光照、酸、氧化、高溫、高濕等條件下均較穩(wěn)定，不易降解產(chǎn)生雜質(zhì)，但在堿性條件下易降解產(chǎn)生雜質(zhì)A。因此，本品在生產(chǎn)和貯藏過程中盡量避免堿性物質(zhì)的影響。

3.3 雜質(zhì)譜及雜質(zhì)限度確定

對檢出的主要雜質(zhì)用國外藥典對照品和高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）進行了結(jié)構(gòu)確認，確認檢出的主要雜質(zhì)為3-甲基黃酮-8-羧酸（雜質(zhì)A）、3-甲基黃酮-8-羧酸甲酯（雜質(zhì) B）和 3-甲基黃酮 -8-羧酸乙酯（雜質(zhì)C），與依據(jù)原料合成過程中推論出的雜質(zhì)基本一致。6個廠家107批樣品中均未檢出雜質(zhì)3-甲基黃酮-8-羧酸乙酯（雜質(zhì)D），破壞試驗中也均未檢出雜質(zhì)D，因此建議質(zhì)量標準中不控制雜質(zhì)D。F廠有2批樣品雜質(zhì)C含量很高，推測可能是原料或制劑生產(chǎn)工藝出現(xiàn)異常引起，具體原因有待進一步研究?？紤]到目前國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制是以中國藥典規(guī)定為準，因此綜合各國藥典規(guī)定和樣品檢驗結(jié)果，暫將限度定為雜質(zhì)A不得超過0.5%，雜質(zhì)B不得超過0.1%，雜質(zhì)C不得超過0.15%，其他單個雜質(zhì)不得超過0.1%，各雜質(zhì)總和不得超過1.0%。

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