李春明,劉藕根,彭亞婷,張淑蘭,張穎鵬,劉志剛

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱皮膚鱗癌)起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞，其發(fā)病率僅次于基底細(xì)胞癌[1,2]。近年來(lái)在視網(wǎng)膜和其他多種細(xì)胞、組織中發(fā)現(xiàn)了一種內(nèi)源性的強(qiáng)效抗腫瘤蛋白，即色素上皮衍生因子(PEDF)，為臨床治療皮膚鱗癌提供了新的思路。目前發(fā)現(xiàn)，PEDF短肽同樣具有生物學(xué)活性，較全長(zhǎng)的PEDF蛋白更容易被載體攜帶且引起的不良反應(yīng)更少。PEDF全長(zhǎng)418個(gè)氨基酸(aa)，Abe等[3]發(fā)現(xiàn)該P(yáng)EDF長(zhǎng)肽片段(301～418 aa)可抑制人成骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖。2014年12月～2016年6月，本研究將該P(yáng)EDF長(zhǎng)肽片段(301～418 aa)人工合成更小的短肽分子(6～7 aa)，篩選出可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的PEDF短肽，并檢測(cè)其透皮性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料

細(xì)胞：人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞株購(gòu)自深圳中洪博元生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： BALB/c裸鼠9只，雌雄不限，4～6周齡，體質(zhì)量16～22 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自上海生物工程有限公司，羅丹明標(biāo)記親合素(Avidin/RBITC)購(gòu)自美國(guó)BD公司，CD31單抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所，OCT包埋劑購(gòu)自美國(guó)Sakura公司。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的18～20 aa短肽篩選

2.1.1 6個(gè)18～20 aa短肽合成 將PEDF長(zhǎng)肽(301～418 aa)序列分成6段，人工合成6個(gè)18～20 aa長(zhǎng)度的短肽，即P1(301～320 aa，氨基酸序列：aaidrelktvqavltvpklkls)、P2(321～340 aa，氨基酸序列：yegevtkslqemklqslfds)、P3(341～360 aa，氨基酸序列：pdfskitgkpikltqvehra)、P4(361～380 aa，氨基酸序列：gfewnedgagttpspglqpa)、P5(381～400 aa，氨基酸序列：hltfpldyhl nqpfifvlrd)、P6(401～418 aa，氨基酸序列：tdtgallfigkildprgp)。所有短肽由上海生工生物工程股份有限責(zé)任公司合成。

2.1.2 18～20 aa短肽篩選 將SCL-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合至90%左右進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SCL-1細(xì)胞，用胰酶/EDTA消化后重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。放置于孵箱中24 h，待細(xì)胞鋪滿孔底部60%～70%時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次。將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察A組和對(duì)照A組，觀察A組分別加入含有P1～P6(短肽濃度均為100 ng/mL)的無(wú)血清DMEM/0.5% BSA各100 μL，對(duì)照A組加入無(wú)血清DMEM/0.5% BSA 100 μL。采用CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖能力(孵育23 h時(shí)每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)孵育1 h。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值，以此表示細(xì)胞增殖能力)，每種處理因素均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，加入P1～P6的觀察A組細(xì)胞吸光度值分別為0.44±0.02、0.45±0.01、0.54±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.52±0.01，對(duì)照A組為0.52±0.02；加入P1、P2的觀察A組細(xì)胞吸光度值明顯低于對(duì)照A組(P<0.05或<0.01)，加入P3～P6的觀察A組細(xì)胞吸光度值與對(duì)照A組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。證實(shí)P1、P2可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖。

2.2 抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的6～7 aa短肽篩選

2.2.1 6個(gè)6～7 aa短肽合成 將P1進(jìn)一步分成3段，人工合成3個(gè)更小的6～7 aa短肽，即P1-1(301～307 aa，氨基酸序列：idrelkt)、P1-2(308～314 aa，氨基酸序列：vqavltv)、P1-3(315～320 aa，氨基酸序列：pklkls)。將P2進(jìn)一步分成3段，合成3個(gè)更小的6～7 aa短肽，即P2-1(321～327 aa，氨基酸序列：yegevtk)、P2-2(328～334 aa，氨基酸序列：slemkl)、P2-3(335～340 aa，氨基酸序列：qslfds)。所有短肽由上海生物工程技術(shù)公司合成。

2.2.2 6～7 aa短肽篩選 參照2.1.2的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為觀察B組和對(duì)照B組。觀察B組分別加入含有P1-1、P1-2、P1-3、P2-1、P2-2、P2-3(短肽濃度均為100 ng/mL)的無(wú)血清DMEM/0.5% BSA各100 μL，對(duì)照B組加入無(wú)血清DMEM/0.5% BSA 100 μL。采用CCK-8法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，加入P1-1、P1-2、P1-3、P2-1、P2-2、P2-3的觀察B組細(xì)胞吸光度值分別為0.44±0.02、0.45±0.01、0.55±0.03、0.54±0.02、0.38±0.02、0.52±0.02，對(duì)照B組為0.54±0.03；加入P1-1、P1-2、P2-2的觀察B組細(xì)胞吸光度值明顯低于對(duì)照B組(P均<0.01)，加入P1-3、P2-1、P2-3的觀察B組細(xì)胞吸光度值與對(duì)照B組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。證實(shí)P1-1、P1-2和P2-2可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖。

2.3 P1-1、P1-2和P2-2短肽的透皮性分析 采用生物素標(biāo)記P1-1、P1-2和P2-2短肽，在人工合成時(shí)給予其N端修飾生物素。將標(biāo)記過(guò)的P1-1、P1-2和P2-2短肽分子用1 mmol/L PBS溶解，取70 μL外涂于裸鼠的局部皮膚。每次使用3只裸鼠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2 h后，剝離短肽分子局部作用部位的裸鼠皮膚組織，采用免疫熒光法觀察其透皮性。方法如下：將皮膚標(biāo)本置于包埋劑OCT中，液氮保存，4 μm厚度連續(xù)切片，轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的蓋玻片表面。4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；加入預(yù)熱的10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液，95 ℃ 加熱20 min；PBS洗3次，每次5 min。用含0.1% Triton-100的PBS室溫穿膜15 min，加入10%兔血清室溫封閉1 min。在不同的蓋玻片上分別滴加Avidin/RBITC及CD31單克隆抗體孵育4 h，PBS洗3次，每次5 min。加入羅丹明標(biāo)記的兔抗鼠二抗(稀釋比例為1∶40)，避光下室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min。避光狀態(tài)下加入1 μg/mL DAPI復(fù)染20 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果顯示，經(jīng)P1-1、P1-2、P2-2短肽外涂的裸鼠皮膚組織血管內(nèi)及血管壁均可檢測(cè)到紅色熒光。證實(shí)P1-1、P1-2和P2-2短肽的透皮性均較好。

3 討論

PEDF是一分子量為50 kD的內(nèi)源性可溶性分泌蛋白，含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為N末端的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)區(qū)域和C末端的絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族反應(yīng)環(huán)。PEDF由SERPINF1基因編碼，該基因位于人的第17號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶中的1亞帶(17p13.1)，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。PEDF最初于1989年由Tombran-Tink從人胚胎視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分離而來(lái)，并證實(shí)其能夠誘導(dǎo)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞分化。后來(lái)發(fā)現(xiàn)PEDF在人體廣泛分布，例如在腦、脊髓、眼、心臟、血管、肝臟、骨組織以及外周血中均可以檢測(cè)到PEDF表達(dá)[4]。在人體皮膚組織中，PEDF在表皮、真皮及皮膚附屬器均有表達(dá)[5]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，PEDF具有抗腫瘤、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、保護(hù)神經(jīng)、抗血管新生、調(diào)節(jié)免疫及脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)功能[6,7]。

目前PEDF的抗腫瘤作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。Wagsater等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PEDF在多種實(shí)體腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)降低或無(wú)表達(dá)；馮子超等[9]發(fā)現(xiàn)，在皮膚基底細(xì)胞癌皮膚組織中PEDF表達(dá)明顯低于正常組織，其認(rèn)為可能此與皮膚基底細(xì)胞癌的發(fā)病密切相關(guān)。既往研究顯示，PEDF表達(dá)降低和前列腺癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤侵襲能力升高及患者預(yù)后不良相關(guān)[10]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PEDF對(duì)前列腺癌、乳腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肺腺癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤等多種腫瘤均發(fā)揮抗腫瘤作用[10～12]。目前認(rèn)為，PEDF主要通過(guò)抗腫瘤血管新生、抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。

研究證實(shí)，PEDF短肽分子同樣具有抗腫瘤作用。44短肽(78～121 aa)可與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y-79細(xì)胞表面80 kDa蛋白結(jié)合，并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化[14]；44短肽(58～101 aa)及其片段(78～94 aa)均可降低細(xì)胞角蛋白K8表達(dá)，提高胃泌素釋放肽mRNA表達(dá)，提示PEDF短肽可以誘導(dǎo)前列腺腺癌細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌分化[15]；25短肽(78～102 aa)有同樣的促神經(jīng)母細(xì)胞瘤和骨肉瘤分化活性，能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[16,17]。部分PEDF短肽參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)黏附，如25短肽(40～64 aa、78～102 aa和90～114 aa)可增加骨肉瘤細(xì)胞和Ⅰ型膠原黏附，25短肽(387～411 aa)可降低骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力[17]；PEDF可能通過(guò)活化Fas/FasL通路而發(fā)揮抗腫瘤作用，并誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯[18,19]。

基于上述研究結(jié)果，本研究推測(cè)PEDF短肽可能具有抗皮膚鱗癌作用。本研究首先發(fā)現(xiàn)18～20 aa PEDF短肽P1(301～320 aa)、P2(321～340 aa)可抑制SCL-1細(xì)胞增殖，提示P1、P2短肽片段存在抑制SCL-1細(xì)胞增殖的功能表位。隨后本研究將P1分成3個(gè)更小的6～7 aa短肽片段P1-1(301～307aa)、P1-2(308～314 aa)和P1-3(315～320 aa)，P2分成3個(gè)更小的6～7 aa短肽片段P2-1(321～327 aa)，P2-2(328～334 aa)和P2-3(335～340 aa)，并證實(shí)P1-1、P1-2和P2-2可抑制SCL-1細(xì)胞增殖；提示成功篩選出可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的6～7 aa PEDF短肽。

本研究在檢測(cè)6～7 aa PEDF短肽皮膚透皮性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了生物素-親和素系統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)。生物素廣泛分布于動(dòng)、植物組織中，常從含量較高的卵黃和肝組織中提取。親和素亦稱抗生物素蛋白、卵白素，是從卵白蛋白中提取的一種由4個(gè)相同亞基組成的堿性糖蛋白，分子量為68 kD，可耐受多種蛋白水解酶的作用，尤其是與生物素結(jié)合后，穩(wěn)定性更好。每個(gè)親和素能結(jié)合4個(gè)分子的生物素，二者之間的親和力極強(qiáng)，親和素結(jié)合生物素的親和常數(shù)可為抗原-抗體反應(yīng)的百萬(wàn)倍，二者結(jié)合形成復(fù)合物的解離常數(shù)很小，呈不可逆反應(yīng)性。因此，生物素-親和素系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中的產(chǎn)物穩(wěn)定性很高。本研究將6～7 aa PEDF短肽使用生物素標(biāo)記，后者通過(guò)與羅丹明標(biāo)記的親合素結(jié)合，可發(fā)出紅色熒光，便于檢測(cè)PEDF短肽的表達(dá)及定位情況。雖然許多生物分子蛋白無(wú)法穿透正常表皮，但是小于1 kD的短肽分子卻有可能穿透皮膚表皮。Abe等[3]篩選出類似的特異的低分子短肽(分子量< 850 Da)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能夠抑制血管新生，皮膚穿透性實(shí)驗(yàn)提示該短肽可以穿透至皮膚真皮層以及皮下血管。本研究人工合成的6～7 aa理論上分子量為720～540 Da，故推測(cè)這些短肽分子能穿透表皮到達(dá)真皮。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)P1-1、P1-2、P2-2短肽外涂的裸鼠皮膚組織血管內(nèi)及血管壁均可檢測(cè)到紅色熒光。證實(shí)6～7 aa短肽分子P1-1、P1-2、P2-2均可以穿透表皮到達(dá)真皮血管位置，透皮性較好。

綜上所述，本研究成功篩選出可抑制皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的6～7 aa PEDF短肽P1-1、P1-2、P2-2，其透皮性均較好，有望用于皮膚鱗癌的治療。