王星璇，胡志和*，柳瀾昱，王麗娟，薛 璐，吳子健

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）不僅產(chǎn)量高，也是百姓餐桌上常見(jiàn)的美味佳肴[1-3]。然而，這樣的美味卻是潛在的食物過(guò)敏原，在過(guò)敏人群中，就有20%會(huì)對(duì)其過(guò)敏[4]，嚴(yán)重影響了過(guò)敏體質(zhì)人群的生活質(zhì)量。采用何種方法可以在保存蝦仁完整結(jié)構(gòu)和風(fēng)味的基礎(chǔ)上，消除其致敏性，讓過(guò)敏群體安全地享受蝦的美味，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

超高靜壓技術(shù)（high hydrostatic pressure processing，HPP）是一種冷殺菌技術(shù)，其作用是純物理過(guò)程，液體傳壓、各向壓力均等的特點(diǎn)能夠保留受壓物體的外觀形狀[5-6]；只作用于構(gòu)成空間結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵，不會(huì)影響共價(jià)鍵[7]；由于加工過(guò)程產(chǎn)生的熱量很小，可以保持食品原有的營(yíng)養(yǎng)成分、色澤和天然風(fēng)味[8-9]。自1899年美國(guó)化學(xué)家Hite[10]將超高壓技術(shù)用于牛乳的保藏研究以來(lái)，目前該技術(shù)已經(jīng)用于乳品[11-13]、果汁[14-15]、果醬[16]、水產(chǎn)品[17-19]、肉類(lèi)[20-22]、谷物[23-24]和蔬菜[25]等的加工。

由于超高靜壓能夠改變蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象[26-27]和促進(jìn)溶質(zhì)擴(kuò)散[28]，因此也用于消減過(guò)敏食物的致敏性。Kato等[29]將精白米置于蒸餾水中并在100～400 MPa的壓力下對(duì)其進(jìn)行加壓處理，可使大量的過(guò)敏性蛋白質(zhì)溶出。Pe?as等[30-31]在200 MPa 和300 MPa條件下處理大豆蛋白，可大幅度降低其致敏性。Husband等[32]研究了熱和高壓對(duì)蘋(píng)果的2 個(gè)主要過(guò)敏原（Mal d 1、Mal d 3）及Bet v 1（類(lèi)似芹菜中過(guò)敏原Api g 1）的影響，發(fā)現(xiàn)通過(guò)加熱或提高壓力可以有效降低其主要過(guò)敏原。張悅等[33]將蝦仁在100 MPa、25 ℃條件下處理15 min，蝦仁的致敏性降低了67.09%，且與處理過(guò)程中蛋白溶出量有關(guān)。蔡秋鳳等[34]研究發(fā)現(xiàn)超高壓使蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，與Ca2+結(jié)合能力變?nèi)酰瑢?dǎo)致小清蛋白的免疫活性降低，從而達(dá)到了對(duì)魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原消減的效果。

本研究利用超高靜壓能夠促進(jìn)溶質(zhì)擴(kuò)散和引發(fā)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化的性能，采用超高靜壓處理南美白對(duì)蝦的鮮蝦仁，在保留蝦仁結(jié)構(gòu)完整的基礎(chǔ)上，消減其致敏性，為利用超高壓技術(shù)降低水產(chǎn)品致敏性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦 天津市韓家墅水產(chǎn)市場(chǎng)。

兔抗南美白對(duì)蝦原肌球蛋白免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體和羊抗人IgE抗體 美國(guó)Sigma公司；Page Ruler Prestained Protein Ladder標(biāo)準(zhǔn)蛋白 美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)板美國(guó)Corning Costar公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；HPP.L2-1000/1型超高壓設(shè)備 華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；3-18K型離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；SpectraMax190型酶標(biāo)分析儀 美國(guó)美谷分子儀器有限公司；UNIVERSAL HOOD Ⅱ凝膠電泳成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；24DN型電泳槽、DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠；FD-2冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UDK159全自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦仁的超高壓處理

將新鮮南美白對(duì)蝦清洗，去頭、尾、殼以及腸線，制成蝦仁。并按照1 個(gè)孔/cm2的密度對(duì)蝦仁進(jìn)行扎孔，稱(chēng)質(zhì)量。將蝦仁與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液按照質(zhì)量比1∶4混合，然后用聚乙烯袋真空密封。采用超高壓設(shè)備處理真空密封的樣品。壓力傳遞介質(zhì)為葵二酸二辛酯，處理溫度為室溫，壓力范圍為0.1～900.0 MPa，保壓時(shí)間為10～50 min。

1.3.2 高壓處理后蝦仁的溶出蛋白及殘留蛋白含量測(cè)定

將處理的蝦仁從溶液中取出，將溶液在4 000 r/min條件下離心15 min，取50 mL上清液檢測(cè)溶出蛋白質(zhì)量濃度；取處理后濕基蝦仁1 g進(jìn)行蝦仁溶出蛋白和殘留蛋白含量的測(cè)定。溶出蛋白質(zhì)量濃度、溶出蛋白含量、殘留蛋白含量均采用GB 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[35]凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.3 高壓處理后蝦仁的溶出蛋白及蝦仁殘留蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布

不同壓力（0.1～900.0 MPa）處理30 min后，將蝦仁取出，溶液4 ℃、4 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)透析（截留分子質(zhì)量3 500 Da）、凍干后獲得溶出蛋白。

蝦仁殘留蛋白的制備參考李振興[36]的方法并進(jìn)行修改。將高壓處理（0.1～900.0 MPa）后的蝦仁勻漿，每克組織用1 mL的生理鹽水懸浮，懸浮液置于冰上5 min后加入4 倍體積冷丙酮（-20 ℃預(yù)冷過(guò)夜），充分混勻，置于0 ℃條件下30 min，期間混勻數(shù)次，于4 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集沉淀物。將沉淀物再次用冷丙酮懸浮、混勻，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min，將沉淀物移至干凈濾紙上自然風(fēng)干，制得蝦蛋白丙酮粉。再將丙酮粉與含有0.5 mmol/L二硫蘇糖醇的1 mol/L KCl抽提液按1∶10（m/V）的比例混合進(jìn)行抽提過(guò)夜，4 ℃、4 000 r/min離心30 min，取上清液，沉淀物用抽提液按1∶10（m/V）抽提4 h，離心取上清液，將兩次的上清液合并后透析（截留分子質(zhì)量3 500 Da），截留物經(jīng)冷凍干燥，獲得蝦仁粗提蛋白。

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析蛋白質(zhì)種類(lèi)。電泳條件：15%分離膠，5%濃縮膠，上樣溶液質(zhì)量濃度5 mg/mL，上樣量10 μL。

利用凝膠電泳成像儀分析電泳膠片，用隨機(jī)Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布。

1.3.4 過(guò)敏血清來(lái)源

血清樣品采集于12 個(gè)蝦過(guò)敏患者，分別來(lái)自山東省榮成市石島人民醫(yī)院、河北省唐山市開(kāi)灤醫(yī)院和甘肅省天水市第一人民醫(yī)院及天津商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院。性別分布為7 男，5 女；年齡分布20～23 歲7 人，35～40 歲4 人，52歲1 人。通過(guò)臨床診斷為蝦類(lèi)過(guò)敏，采用皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)結(jié)果大于陽(yáng)性對(duì)照范圍的1/2為“++”，將所有患者的血清混合；另外，采集20 名非過(guò)敏人的血清（天津商業(yè)大學(xué)校醫(yī)院），作為陰性對(duì)照。所有血清樣品置于-80 ℃冰箱凍存。

1.3.5 IELISA法檢測(cè)高壓處理后蝦仁蛋白及溶出蛋白的致敏性

從不同條件處理后的蝦仁中提取蛋白，分別用兔抗原肌球蛋白的IgG抗體、對(duì)蝦過(guò)敏的人血清為一抗，以未處理組蝦仁中提取的蛋白為對(duì)照，采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（indirect enzyme-linked immunosorbent assay，IELISA）法檢測(cè)蝦仁的致敏性[37]，通過(guò)抗體與抗原結(jié)合的光密度值變化，表示致敏性的變化。具體操作如下。

將高壓處理蝦仁的蛋白提取物或溶出蛋白用pH 9.6的Na2CO3/NaHCO3緩沖液配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，向酶標(biāo)板中每孔加入100 μL，4 ℃下包被26 h。棄掉抗原稀釋液，用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）（1 000 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中含1 mL吐溫20）洗板，拍干后每孔加入封閉液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白的PBST）200 μL，37 ℃下保溫2.5 h。棄去封閉液，用PBST洗板，拍干。每孔加入100 μL抗體溶液（蝦過(guò)敏患者血清用封閉液1∶160（V/V）稀釋?zhuān)每鼓厦腊讓?duì)蝦原肌球蛋白IgG抗體用封閉液1∶750（V/V）稀釋?zhuān)?7 ℃下孵育2 h，棄去孔中液體，用PBST洗板。每孔加100 μL二抗溶液（HRP標(biāo)記的羊抗人IgE抗體用封閉液1∶800（V/V）稀釋?zhuān)琀RP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體用封閉液1∶1 000（V/V）稀釋?zhuān)?7 ℃下孵育1 h。棄去孔中液體，用PBST洗板，拍干。每孔加入100 μL鄰苯二胺底物液（0.1 mol/L檸檬酸4.86 mL、0.2 mol/L Na2HPO45.14 mL、4 mg鄰苯二胺、3% H2O250 μL），37 ℃下閉光放置15 min，然后每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液。用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值（OD492nm）。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)平行。

包被在酶標(biāo)板中的抗原與抗體（蝦仁中提取的蛋白）結(jié)合后形成抗原-抗體復(fù)合物，與再加入酶標(biāo)二抗反應(yīng)，通過(guò)顯色液顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定其光密度值。光密度值可以反映出抗原和抗體結(jié)合的程度。蝦仁蛋白致敏性的消減率按照下式計(jì)算。

1.3.6 高壓下蛋白溶出與變性結(jié)合消減蝦仁致敏性

將真空密封后的蝦仁，在200 MPa室溫保壓30 min的條件下進(jìn)行處理。然后在600 MPa室溫保壓不同時(shí)間（10～30 min）條件下進(jìn)行高壓處理，檢測(cè)每次處理后蝦仁致敏性變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，顯著性分析采用單因素方差分析方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以表示，圖表制作利用軟件Origin 8和Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓處理時(shí)間對(duì)蝦仁蛋白質(zhì)溶出量的影響

將真空密封的蝦仁，在室溫和300.0 MPa壓力下分別處理10、20、30、40、50 min，通過(guò)凱氏定氮法檢測(cè)處理后溶出液中蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 室溫、300.0 MPa條件下不同保壓時(shí)間對(duì)蝦仁蛋白質(zhì)溶出量的影響Fig.1 Effect of treatment time at 300.0 MPa and at room temperature on protein solubilization

由圖1可知，不同保壓時(shí)間處理的蝦仁蛋白質(zhì)溶出量均有顯著性差異（P＜0.05）。在室溫、300.0 MPa下，保壓時(shí)間在10～30 min內(nèi)，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)溶出量增多，當(dāng)保壓時(shí)間為30 min時(shí)，蛋白質(zhì)溶出量最高，為25.69 mg/g；在30～50 min范圍內(nèi)，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，其蛋白質(zhì)的溶出量逐漸降低。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦仁蛋白質(zhì)的變性導(dǎo)致溶解性的變化[38]。

2.2 壓力對(duì)蝦仁的蛋白質(zhì)溶出量及剩余量的影響

在室溫下，用不同壓力（0.1～900.0 MPa）處理蝦仁30 min，蝦仁和溶出液中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果如圖2所示。

超高壓處理會(huì)使蝦仁中蛋白質(zhì)溶出，各壓力下蛋白質(zhì)溶出量均高于對(duì)照組（0.1 MPa）；當(dāng)壓力小于200.0 MPa時(shí)，隨壓力提高，溶出蛋白量逐漸增高；當(dāng)壓力大于200.0 MPa時(shí)，隨壓力增大，蛋白溶出量逐漸降低（圖2）。在實(shí)驗(yàn)的壓力范圍內(nèi)，200.0 MPa時(shí)蛋白溶出量最多，為37.9 mg/g。另外，蝦仁中殘留的蛋白質(zhì)含量在200.0 MPa時(shí)最低，為146.1 mg/g；因此，200.0 MPa的處理?xiàng)l件有利于蛋白質(zhì)的溶出。其原因可能是因?yàn)楫?dāng)壓力在200.0 MPa時(shí)，蛋白質(zhì)極性基團(tuán)的暴露增多，蛋白質(zhì)的水化作用增強(qiáng)，溶解性得到極大提高，導(dǎo)致蝦仁蛋白質(zhì)更多地溶出[39-40]。隨著壓力的繼續(xù)增大（300.0～900.0 MPa），蝦仁蛋白溶出量隨壓力增大而減小。過(guò)高的壓力導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠發(fā)生破裂，大分子蛋白聚合體解聚，疏水位點(diǎn)與新的二硫鍵暴露，產(chǎn)生不同組分的聚集變性[41-43]。

圖2 室溫下不同壓力處理30 min對(duì)蝦仁的蛋白質(zhì)溶出量的影響Fig.2 Effect of pressure at room temperature for 30 min on protein solubilization

2.3 不同壓力下蝦仁溶出蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布

不同壓力對(duì)蛋白質(zhì)空間構(gòu)象產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子某些性質(zhì)變化，其中包括其溶解性能。不同壓力處理蝦仁，溶出蛋白SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖3，電泳圖經(jīng)凝膠電泳成像儀分析其分子質(zhì)量分布，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，對(duì)照組蝦仁共有26 種蛋白質(zhì)溶出，與蝦仁粗提蛋白種類(lèi)一致。經(jīng)超高壓處理后，壓力為100.0 MPa時(shí)，沒(méi)有分子質(zhì)量為106.7 kDa的蛋白質(zhì)溶出；在200.0～300.0 MPa壓力處理?xiàng)l件下，蝦仁溶出蛋白種類(lèi)一致，有2 種蛋白（106.7 kDa和191 kDa）沒(méi)有溶出；壓力不低于400.0 MPa時(shí)，分子質(zhì)量超過(guò)106 kDa的5 種蛋白沒(méi)有溶出；當(dāng)壓力為500.0 MPa時(shí)，有14 種蛋白沒(méi)有溶出；當(dāng)壓力在600.0～900.0 MPa之間時(shí)，溶出蛋白種類(lèi)相同，有17 種蛋白沒(méi)有溶出。造成這一現(xiàn)象的原因，可能是在高壓作用下蛋白質(zhì)水合作用發(fā)生變化，導(dǎo)致其溶解性變化[38-44]。

圖3 不同壓力下溶出蛋白的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of protein solubilization after treatment at different pressures for 30 min at room temperature

表1 不同條件下處理的溶出蛋白分子質(zhì)量分布Table1 Molecular weight distribution of proteins from shelled shrimp treated at different pressures

另外，蝦類(lèi)主要的過(guò)敏原蛋白為分子質(zhì)量36 kDa的原肌球蛋白[45]，在各種壓力下均有溶出。采用凝膠電泳成像儀對(duì)電泳圖譜（圖3B）的分析發(fā)現(xiàn)，在200.0 MPa下處理蝦仁，溶出蛋白中36 kDa蛋白占較高的比例（圖4）；這一結(jié)果為高壓溶出消減蝦仁致敏性提供了理論依據(jù)。

圖4 不同壓力下溶出蛋白液中分子質(zhì)量為36 kDa的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Fig.4 Concentration of 36 kDa proteins from shelled shrimp treated at different pressures

2.4 高壓處理后蝦仁提取蛋白及溶出蛋白的致敏性變化

2.4.1 高壓處理后蝦仁提取蛋白的致敏性變化

圖5 不同壓力作用下蝦仁致敏性消減結(jié)果Fig.5 Effect of HHP treatment at different pressures on allergenicity of shelled shrimp

由圖5可知，加壓可以降低蝦仁的致敏性，不同的高壓條件下蝦仁致敏性的消減率有顯著差異（P＜0.05）。壓力在100.0～600.0 MPa的范圍內(nèi)，隨著壓力的增加，抗體與抗原結(jié)合的OD492nm隨之減?。划?dāng)壓力在600.0～900.0 MPa范圍內(nèi)，抗體與抗原結(jié)合的OD492nm隨壓力增大而提高，且采用兔抗TM的IgG為一抗抗體（圖5A）和用過(guò)敏者血清為一抗抗體（圖5B）檢測(cè)結(jié)果的趨勢(shì)一致。在600.0 MPa下致敏性消減效果最好，與未處理的蝦仁提取蛋白（OD492nm為0.34）相比，用過(guò)敏者血清為一抗檢測(cè)，致敏性消減了41.82%（圖5B）；用兔抗TM的IgG為一抗檢測(cè)，致敏性消減了44.15%（圖5A）。

此外，比較不同壓力下蝦仁致敏性（圖5）與蝦仁殘留蛋白含量或溶出蛋白含量（圖2A）之間關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)壓力在0.1～300.0 MPa范圍內(nèi)，其致敏性變化與蝦仁中殘留蛋白含量正相關(guān)，與溶出蛋白含量負(fù)相關(guān)；壓力在400.0～900.0 MPa之間，其致敏性變化與蝦仁蛋白的殘留量和溶出量無(wú)關(guān)。因此，可以推斷在0.1～300.0 MPa范圍內(nèi)，蝦仁致敏性消減與蝦仁蛋白溶出有關(guān)；在400.0～900.0 MPa范圍內(nèi)，致敏性變化與蝦仁蛋白變性有關(guān)。

2.4.2 高壓處理后蛋白溶出量及變性與致敏性關(guān)系

圖6 不同壓力處理的蛋白溶出液稀釋12.5 倍后致敏性變化Fig.6 Allergenicity of 12.5-fold diluted proteins from shelled shrimp treated at different pressures

比較圖6和圖2可知，壓力在0.1～300.0 MPa范圍內(nèi)，其致敏性變化與蛋白溶出量正相關(guān)；在100.0、400.0 MPa和500.0 MPa下處理的蝦仁的溶出蛋白含量無(wú)顯著差異（圖2A），但溶出蛋白的致敏性存在顯著差異（圖6）；因此，當(dāng)壓力大于400.0 MPa時(shí)，蝦仁蛋白的致敏性與溶出量無(wú)關(guān)，與其構(gòu)象的變化（變性）有關(guān)[46]。

將溶出蛋白冷凍干燥，配制成0.5 mg/mL的溶液后進(jìn)行包被，檢測(cè)其致敏性（用過(guò)敏者血清為一抗檢測(cè)），研究溶出蛋白致敏性與變性的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖7。壓力在0.1～600.0 MPa范圍內(nèi)，隨著壓力的增大，其致敏性逐漸降低，在600.0 MPa時(shí)，致敏性最低，與未處理蝦仁蛋白相比，消減率為59.85%，且100.0 MPa和200.0 MPa時(shí)致敏性無(wú)顯著差異；當(dāng)壓力在600.0～900.0 MPa范圍內(nèi)，隨壓力的增加，其致敏性反而增大。

比較圖7與圖3可知，高壓處理會(huì)改變蛋白構(gòu)象，從而導(dǎo)致其某些性質(zhì)的變化，包括溶解性（圖3），進(jìn)而導(dǎo)致致敏性變化（圖7）；但蛋白構(gòu)象變化程度（變性程度）不同，導(dǎo)致其溶解性及致敏性變化程度不同，在較低的壓力下（≤300.0 MPa），蝦仁蛋白只有2 種蛋白不能溶出（圖3），致敏性消減率只有25.53%（300.0 MPa）；400.0 MPa壓力下，有5 種蛋白沒(méi)有溶出，且均為大分子蛋白（分子質(zhì)量大于等于106 kDa）（圖3），致敏性消減率為29.41%；但當(dāng)壓力大于500.0 MPa時(shí)，有14～17 種蛋白沒(méi)有溶出（圖3），且致敏性消減率為54.18%（500.0 MPa）。因此，引起蝦仁多種蛋白變性的壓力應(yīng)不低于500.0 MPa，且在600.0 MPa下致敏性消減較好（致敏性消減率為68.79%）。

圖7 不同壓力處理后的蝦仁溶出蛋白的致敏性Fig.7 Allergenicity of proteins from shelled shrimp treated at different pressures

2.5 蛋白溶出與變性相結(jié)合消減蝦仁致敏性

綜合不同高壓條件下蝦仁蛋白溶出量（圖2）、變性與致敏性關(guān)系（圖7），采用200.0 MPa和600.0 MPa相結(jié)合的處理方式，消減蝦仁的致敏性。

2.5.1 在200.0 MPa下多次處理對(duì)蝦仁致敏性的消減

將蝦仁在200.0 MPa保壓處理30 min的條件下，進(jìn)行多次處理，蛋白溶出質(zhì)量濃度變化和蝦仁殘留蛋白致敏性變化見(jiàn)圖8。處理4、5、6 次的蛋白溶出量和蝦仁致敏性均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與處理3 次相比，存在顯著差異（P＜0.05）。因此，從蛋白溶出量分析，處理4 次即可。綜上，200.0 MPa、室溫、保壓處理30 min，經(jīng)4 次處理，蝦仁的致敏性降低到較平穩(wěn)水平（OD492nm為0.107），與未處理蝦仁蛋白（OD492nm為0.340）相比，致敏性消減率為68.53%。

圖8 在200.0 MPa下處理次數(shù)對(duì)溶出液蛋白質(zhì)量濃度（A）和蝦仁殘留蛋白致敏性（B）的影響Fig.8 Effect of number of 200.0 MPa treatments on protein solubilization (A) and allergenicity of shelled shrimp (B)

2.5.2 蛋白溶出與變性結(jié)合處理對(duì)蝦仁致敏性消減效果

蝦仁在200.0 MPa室溫保壓30 min的條件下處理后，再經(jīng)600.0 MPa、室溫保壓處理，每次處理后提取蝦仁蛋白，用過(guò)敏者血清為一抗，檢測(cè)致敏性變化，結(jié)果見(jiàn)表2。采用單一蛋白溶出（200.0 MPa）或蛋白變性（600.0 MPa）均不能較好地消減蝦仁的致敏性，而采用二者結(jié)合，先用200.0 MPa處理30 min，再用600.0 MPa處理20～30 min，就能夠較好地降低蝦仁的致敏性，蝦仁在200.0 MPa下處理30 min后，再用600.0 MPa處理30 min，蝦仁的致敏性消減率大于80%。

表2 經(jīng)200.0 MPa處理后再經(jīng)600.0 MPa處理對(duì)蝦仁致敏性的影響（n＝ 3）Table2 Effect of sequential treatment at 200.0 MPa followed by 600.0 MPa on allergenicty of shelled shrimp (n= 3)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即使采用兩種方法相結(jié)合的方式，也不能徹底消除蝦仁蛋白的致敏性。其原因在于，采用蛋白溶出的方式，由于溶解平衡，不能夠徹底溶出所有過(guò)敏原蛋白；采用蛋白變性的方式，只是通過(guò)改變蛋白空間構(gòu)象從而改變其致敏性[47]。另外，高壓處理是物理過(guò)程，只能改變過(guò)敏原蛋白的構(gòu)象表位，不會(huì)破壞其一級(jí)結(jié)構(gòu)，即不會(huì)影響線性表位；因此，采用高壓處理，不能完全消除蝦仁蛋白的致敏性。

3 結(jié) 論

采用超高壓處理技術(shù)，能夠有效地消減蝦仁蛋白的致敏性。在處理過(guò)程中，不同壓力對(duì)蝦仁蛋白致敏性消減的作用方式不同，當(dāng)壓力在100.0～300.0 MPa的范圍內(nèi)，可促進(jìn)蝦仁中致敏性蛋白的溶出，從而使得蝦仁的致敏性降低；壓力400.0～900.0 MPa范圍，可促進(jìn)蝦仁致敏性蛋白結(jié)構(gòu)的改變，從而使蝦仁的致敏性發(fā)生變化。采用適合蝦仁致敏性蛋白溶出和構(gòu)象改變的壓力相結(jié)合的方式處理蝦仁，能夠更好地消減蝦仁致敏性。

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