孫志偉 李紅月

【摘要】目的：建立測定天麻藥材中兩種主要化學(xué)成分的HPLC含量測定方法;在此基礎(chǔ)上，測定宜昌栽培天麻天麻素、對羥基苯甲醇含量與栽培年限之間的變化關(guān)系。方法：采用HPLC對不同生長年限栽培天麻中天麻素、對羥基苯甲醇含量進(jìn)行測定。結(jié)果：天麻中各天麻素、對羥基苯甲醇含量隨栽培年限變化較大。結(jié)論：本方法簡便、可靠，可用于天麻中天麻素、對羥基苯甲醇含量測定。

【關(guān)鍵詞】天麻;不同年限;含量測定;HPLC

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBlume的干燥塊莖，主產(chǎn)于云南、四川、陜西、貴州、湖北等地，具有平肝息風(fēng)、祛風(fēng)定驚、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等功效[1]，含有酚類、多糖、甾醇、有機(jī)酸等多種成分[2]，而天麻素、對羥基苯甲醇等酚類化合物通常被認(rèn)為是天麻的主要活性成分。2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，按干品計，天麻素和對羥基苯甲醇總含有量不得低于0.25%[3]，也是以天麻素及對羥基苯甲醇的含量作為天麻質(zhì)量評價指標(biāo)。

宜昌是天麻栽培主產(chǎn)區(qū)之一，然天麻種植多以農(nóng)戶散種為主，種植規(guī)范性較差，采收年限存在較大差異[4]。天麻屬多年生植物，作為次生代謝產(chǎn)物的苷類等有效成分的積累可能與植物的生長年限存在相關(guān)性。然而對于天麻栽培品栽培年限對天麻有效成分積累的研究，國內(nèi)外文獻(xiàn)少有報道?；诖耍狙芯恳蕴炻樗?、對羥基苯甲醇為指標(biāo)研究天麻栽培品栽培年限與天麻有效成分積累的關(guān)系。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀， 含Waters2690色譜工作站（美國Water公司）;TC-C18色譜柱色譜柱，（4.6mmx250mm，5μm）（安捷倫公司）;BT-125D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）;KQ-500B型超聲波振蕩清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;天麻素（中國食品藥品檢定研究院，批號110807-200205）;對羥基苯甲醇（中國食品藥品檢定研究院，批號111970～201405）。

色譜分析用乙腈（色譜純，美國Fisher公司）;水為娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。

不同年限天麻栽培品均采集自宜昌市夷陵區(qū)聚寶天麻專業(yè)種植基地。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相為乙腈-0.05%磷酸（5：95）。流速為l.OmL.min-1。波長210nm，柱溫30℃。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取天麻素對照品10.6mg及對羥基苯甲醇對照品5.8mg，加50%甲醇定容于5 0mL容量瓶中，制成濃度為含天麻素0.212mg/mL、對羥基苯甲醇0.116mg/mL的混合對照品溶液儲備液。取上述溶液lOμL進(jìn)樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖（見圖1）。

2.3 供試品溶液制備

取天麻，粉碎，過5號篩，精密稱定細(xì)粉約lg，加60%甲醇超聲提取30min，過濾，取濾液定容于lOOmL容量瓶中，搖勻。再用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。取各供試品溶液lOμL進(jìn)樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖（見圖2）。

2.4 工作曲線繪制

精密吸取2.2項下對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、8.Oml，定容于lOml容量瓶中，上述溶液進(jìn)樣lOμL，測定峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為：天麻素Y=235.742X+0.764，F(xiàn)0.9996， 線性范圍為0.01-0.16μg/mL，對羥基苯甲醇Y=396.745X+1.064.F0.9994，線性范圍為0.01-0.12μg/mL。

2.5 精密度試驗

吸取等體積的對照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣，按“2.1”項條件下測定5次，記錄兩峰峰面積。結(jié)果天麻素的RSD值為0.64%（n=5），對羥基苯甲醇的RSD值為0.43%（n=5），均顯示儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取3年生天麻供試品，分別于0、2、4、6、8、lOh測定，結(jié)果天麻素的RSD值為3.18% （n=6），對羥基苯甲醇的RSD值為2.45%（n=6），表明樣品溶液在lOh內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取3年生天麻粉末lg，按“2.3”項下制備供試樣品溶液6份，在“2.1”項條件下色譜條件下進(jìn)樣lOμL，根據(jù)線性回歸方程計算天麻素、羥基苯甲醇含量，結(jié)果天麻藥材中天麻素的含量平均為2.69mg.g^-1，RSD=0.96% （n=6）;對羥基苯甲醇的含量平均為1.16mg-g^-1，RSD=1.31% （n=6）。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定天麻樣品0.5g，精確加入約5mg天麻素及對羥基苯甲醇對照品，混勻后，按“2.1”項下方法重復(fù)測定5次，天麻素平均回收率為102.12，RSD=3.48%，對羥基苯甲醇平均回收率為98.47，RSD=2.68%。

2.9 樣品含量的測定

取宜昌市夷陵區(qū)聚寶天麻專業(yè)種植基地采集的栽培期限為1-4年生的天麻藥材4批，干燥后，按“2.3”項下方法處理。精密吸取供試品溶液，進(jìn)樣lOμL，用外標(biāo)法測定含量，不同栽培年限天麻天麻素、對羥基苯甲醇含量見見表l。

3 討論

（l）在提取方式考察上，本實驗采用正交實驗法考察不同濃度的甲醇、乙醇作為溶劑及不同提取時間等因素對提取率的影響，最終確定本實驗采用的60%甲醇超聲提取30min的最佳提取方法。

（2）本實驗考察了乙腈一水、乙腈一磷酸溶液、乙腈一三氟乙酸、乙腈一乙酸銨溶液等流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸分離效果較好。

（3）在對湖北宜昌不同栽培年限天麻進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)1-4年生栽培天麻均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。但1-3年生天麻，隨著栽培年限的提高，天麻素與對羥基苯甲醇總量有所下降，可能是由于此生長階段，藥材生長速度較快，淀粉、纖維素等初級代謝產(chǎn)物積累較多，其積累速率大于有效成分積累速率所致;第4年天麻素與對羥基苯甲醇含量有所提升，也可能由于此時藥材增重速率變慢，有效成分積累速率相對更快所致。

參考文獻(xiàn)

[1]李云，王志偉，耿巖玲等，天麻素注射液的藥理機(jī)制及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國藥房，2016，27 （32）：4602-4604.

[2]吳仲珍，李育生，劉麗丹等.天麻有效成分的藥理功效及其提取工藝的研究進(jìn)展[J].保鮮與加工，2014，14 （03）：5861.

[3]國家藥典委員會，中華人民共和國藥典：201 5年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2 015： 59.

[4]張躍進(jìn)，梁鎖，周元等，不同栽培措施對天麻產(chǎn)量和產(chǎn)量結(jié)構(gòu)的影響研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009， 37 （03）：1134-1135.