程麗云，史貴軍，方春曉，李光華，鄭勇，陳衛(wèi)剛

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子 832000)

食管癌是起源于食管上皮的惡性腫瘤，是常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。我國是世界上食管癌發(fā)病率較高的國家之一，病理類型以鱗癌為主，其中位于新疆北部的哈薩克族是我國食管鱗癌發(fā)病率最高的民族。1990年的全國死因回顧調(diào)查資料顯示，新疆哈薩克族食管癌的標(biāo)化病死率為68.95/10萬，2000～2005年較前有所下降，但仍維持在較高水平，嚴(yán)重威脅著哈薩克族人的身體健康[2]。由于食管癌早期無明顯癥狀，大部分患者確診時已達中晚期，故5年生存率較低，而早期發(fā)現(xiàn)并治療的食管癌患者預(yù)后明顯優(yōu)于中晚期[3]，因此，建立早期的監(jiān)測體系對于食管癌的診斷和治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指長度在200～1 000 nt，具有調(diào)控基因表達作用的非編碼RNA。近年來研究[4]表明，大量的lncRNA在腫瘤組織與正常組織中差異表達，而且特異的lncRNA可作為腫瘤的預(yù)測因子。有研究[5]表明，與正常組織相比，lncRNA MIR663AHG在胃癌組織中表達顯著上調(diào)，可能與胃癌的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)，但lncRNA MIR663AHG在其他腫瘤中的作用研究較少。本研究通過qRT-PCR方法觀察lncRNA MIR663AHG在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中的表達情況，并進一步分析lncRNA MIR663AHG相關(guān)的mRNA，初步探討lncRNA MIR663AHG在新疆哈薩克族食管鱗癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年11月～2015年9月來源于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兵團內(nèi)鏡中心就診的17例食管鱗癌患者，其中哈薩克族7例(觀察組)、漢族10例(對照組)。觀察組男4例、女3例，年齡(66.14±5.46)歲。對照組男6例、女4例，年齡(64.43±9.25)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。所有患者經(jīng)病理診斷為中分化食管鱗癌，并且在樣本采集前未行任何手術(shù)治療、放療及化療。取兩組患者食管鱗癌組織和配對的癌旁組織，迅速放入凍存管中，并立即置入液氮中儲存過夜，隨后放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。本研究所有樣本的采集處理?jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并征得患者和(或)家屬知情同意。

1.2 lncRNA MIR663AHG表達檢測 采用qRT-PCR法。在無RNase的條件下，應(yīng)用microRNA提取試劑盒提取標(biāo)本中的總RNA。利用紫外分光光度計測定樣本的吸光度值，以檢測樣本總RNA濃度和純度。組織樣本A260/A280介于1.8～2.0為合格，將合格樣品保存至-80 ℃冰箱中備用。應(yīng)用Fast Quant RT試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成20 μL cDNA樣本，待反應(yīng)結(jié)束后置于冰上。lncRNA MIR663AHG上游引物為5′-GGTACACTGGTCGACAAAACC-3′，下游引物為5′-TGGAGACGCTATCTCGGGTA-3′；GAPDH上游引物為5′-TGTTG-CCATCAATGACCCCTT-3′，下游引物為5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。qRT-PCR反應(yīng)總體積為10 μL，含2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，cDNA模板0.5 μL，上下游引物各0.25 μL，無核酸酶水4 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s；60 ℃退火、延伸1 min，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算lncRNA MIR663AHG相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.3 lncRNA MIR663AHG相關(guān)mRNA分析 本課題組前期通過北京博奧生物有限公司定制的Agilent人類lncRNA芯片V4.0(該芯片包含34 235個mRNA檢測探針和40 916個lncRNA檢測探針)篩選出了新疆哈薩克族食管鱗癌腫瘤組織與正常組織差異表達的lncRNA和mRNA表達譜。利用基因芯片數(shù)據(jù)，將觀察組食管鱗癌及其癌旁組織中l(wèi)ncRNA MIR663AHG的表達信號值與篩選出的2 475個差異表達mRNA的表達信號值的趨勢進行相關(guān)性分析，并篩選出與lncRNA MIR663AHG顯著相關(guān)的mRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)：相關(guān)系數(shù)>0.8或相關(guān)系數(shù)<-0.8，并且P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組lncRNA MIR663AHG表達比較 觀察組食管鱗癌組織、癌旁組織中l(wèi)ncRNA MIR663AHG的相對表達量分別為9.07±3.60、1.18±0.71，兩者相比P<0.05。對照組食管鱗癌組織、癌旁組織中l(wèi)ncRNA MIR663AHG的相對表達量分別為3.43±3.42、1.31±0.92，兩者相比P>0.05。觀察組與對照組食管鱗癌組織中l(wèi)ncRNA MIR663AHG的相對表達量分別為6.11±3.91、1.06±0.61，兩者相比P<0.05。

2.2 與lncRNA MIR663AHG相關(guān)的mRNA 共篩選出16個與lncRNA MIR663AHG顯著相關(guān)的mRNA，分別為ZNF503(r=-0.870，P=0.000)、PIK3C2A(r=-0.867，P=0.000)、HCFC2(r=-0.841，P=0.000)、WDR82(r=-0.819，P=0.000)、NDFIP2(r=-0.819，P=0.000)、USP47(r=-0.814，P=0.000)、CYFIP1(r=-0.811，P=0.000)、UBE2B(r=-0.808，P=0.000)、NIPSNAP3A(r=-0.805，P=0.000)、NAT8B(r=0.809，P=0.000)、TMEM132C(r=0.810，P=0.000)、ENDOV(r=0.816，P=0.000)、LOC388210(r=0.821，P=0.000)、KRTAP10-7(r=0.830，P=0.000)、ERVMER34-1(r=0.865，P=0.000)、CDHR5(r=0.879，P=0.000)。

3 討論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，從基因水平對食管鱗癌發(fā)病機制的研究不斷深入。哈薩克族是我國食管鱗癌高發(fā)的民族，目前有研究[6,7]表明哈薩克族與漢族食管鱗癌在基因表達方面存在一定的差異。因此，尋找與哈薩克族食管鱗癌相關(guān)的特異基因可能對降低其發(fā)病率及病死率具有重要的意義。lncRNA不僅可在多個水平參與基因表達調(diào)控[8]，而且可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤中起到重要的作用[9,10]。大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織與正常組織中差異表達，而且特異的lncRNA可作為腫瘤的預(yù)測因子[11,12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIR663AHG在食管鱗癌組織及癌旁組織中均有表達，但與正常食管組織相比，lncRNA MIR663AHG在哈薩克族食管鱗癌組織中表達上調(diào)，而在漢族食管鱗癌組織中表達無差異，并且其在哈薩克族食管鱗癌組織中的表達量高于漢族。表明lncRNA MIR663AHG可能在哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起作用，而與漢族食管鱗癌無關(guān)。lncRNA MIR663AHG的高表達可能是哈薩克族食管鱗癌發(fā)病率高于漢族的又一個重要的影響因素。lncRNA MIR663AHG在哈薩克族食管鱗癌組織中高表達，可能與哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生、腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等相關(guān)。

lncRNA作為細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)控因子，本身不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但是可以通過調(diào)控特定的基因來發(fā)揮生物學(xué)功能。本研究中，我們利用本課題組前期基因芯片的結(jié)果篩選出與lncRNA MIR663AHG相關(guān)的mRNA，以期通過對相關(guān)mRNA功能的分析來初步分析lncRNA MIR663AHG在食管鱗癌中的生物學(xué)作用。本研究共篩選出16個與lncRNA MIR663AHG顯著相關(guān)的mRNA。PIK3C2A屬于磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族，可能參與整合素依賴的信號途徑及與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、致癌轉(zhuǎn)化等相關(guān)的信號途徑。USP47屬于泛素特異性蛋白酶(USPs)家族。目前研究發(fā)現(xiàn)，USPs家族中的一些成員在表觀調(diào)控與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等方面有一定的作用[13]，但是大多數(shù)USPs家族成員的生物學(xué)作用卻不為人知。Zhang等[14]研究表明，下調(diào)USP47的表達能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長，USP47可能是胃癌的一個新的癌基因。CYFIP1位于人類15號染色體長臂的11.2區(qū)域(15q11.2)，該區(qū)域是染色體缺失、重排的活躍區(qū)域。CYFIP1基因與抑癌基因p53作用相似，其表達下調(diào)與乳腺癌、肺癌、膀胱癌等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，是一個候選的抑癌基因[15]。陳旭[16]研究也表明，CYFIP1在鼻咽癌組織中表達下調(diào)，且與鼻咽癌的臨床分型、局部浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CYPIF1表達下調(diào)可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。其余mRNA在腫瘤中未見相關(guān)報道，但在本研究中這些mRNA在哈薩克族食管鱗癌組織中差異表達，其在腫瘤中的作用尚需進一步驗證。目前對于lncRNA MIR663AHG在腫瘤中的作用尚不明確，lncRNA MIR663AHG可能通過與相關(guān)基因的相互作用在腫瘤中發(fā)揮一定的生物學(xué)作用，其在食管鱗癌中的作用尚需進一步探討?？蛇M一步擴大樣本量，探討lncRNA MIR663AHG的表達量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并通過體內(nèi)外實驗進一步探討其對食管鱗癌生物學(xué)作用的影響。

綜上可見，lncRNA MIR663AHG在新疆哈薩克族食管鱗癌組織中高表達，其可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)mRNA參與哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

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