余華軍，伍俊，吳尚，李慧敏，黃慧，張海濤

血栓性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，在急性冠脈綜合征、缺血性腦卒中等心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。隨著環(huán)境的巨變及社會(huì)壓力的劇增，血栓的發(fā)病率與病死率逐年上升，而且血栓性疾病的致殘率也居高不下。因此尋找新型的、能夠防治血栓形成的天然藥物有深遠(yuǎn)的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在前期研究中，本課題組從麒麟菜中分離出具有抑制血小板聚集功能的多肽組分，顯示麒麟菜多肽在抑制血栓形成領(lǐng)域可能有潛在應(yīng)用價(jià)值。目前常用角叉菜膠誘導(dǎo)制備小鼠尾部血栓形成模型[1-2]，該法可根據(jù)鼠尾皮膚顏色變化觀察血栓形成的過程，并分析藥物對(duì)血栓形成的影響，方法簡單而直觀。本研究采用腹腔注射角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓模型[3]，觀察麒麟菜多肽對(duì)血栓形成的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1自動(dòng)低壓液相色譜分離層析儀(上海嘉鵬生物公司)，CF16RX冷凍離心機(jī)(日本 Hitachi公司)，F(xiàn)LASH連續(xù)光譜熒光酶標(biāo)儀(德國 Thermo公司)，HP1100高效液相色譜儀(美國HP公司)，電泳設(shè)備(美國Bio-Rad公司)。

1.1.2 動(dòng)物和試劑 SPF級(jí)昆明小鼠35只，18～22g，雌雄各半，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。麒麟菜(海南瓊海)，Sephadex G-50 (臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)，氯吡格雷、二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶(北京鼎國公司)，角叉菜膠(美國Sigma公司)，其余為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 麒麟菜多肽的制備 從海南瓊海收集麒麟菜，用蒸餾水漂洗干凈，置于20mmol/L的鹽酸溶液中浸泡過夜。第，天用勻漿機(jī)打碎勻漿，勻漿液8000r/min離心30min，收集上清液；上清加入1.5%KCl再次離心，收集上清液。將上清液用Sephadex G-50分離，20mmol/L鹽酸洗脫，1.0ml/min流速，收集280nm處具有光吸收峰的物質(zhì)。共收集2個(gè)洗脫峰，多肽成分集中在第2個(gè)收集峰。用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步純化該多肽。高效液相測(cè)試參數(shù)如下：色譜柱C18(250.0mm×4.6mm)，檢測(cè)波長280nm，柱溫25℃，上樣量20μl，流速1ml/min；流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸，流動(dòng)相C為乙腈(CAN)；梯度洗脫0～3min為B/C=97.0/3.0，3～5min為B/C=97.0/3.0，5～10min為B/C=60.0/40.0，10～20min為B/C=60.0/40.0[4]。純化的多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.2 光學(xué)比濁法檢測(cè)血小板聚集 富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)和乏血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)的制備方法為取2管枸櫞酸鹽抗凝新鮮豬血，靜置30min，分別經(jīng)800r/min、10min和4000r/min、10min離心取上清，分別得到PRP和PPP[5]。

實(shí)驗(yàn)分為4組：正常生理鹽水(N)組、麒麟菜多肽低劑量(Q-L)組、麒麟菜多肽中劑量(Q-M)組、麒麟菜多肽高劑量(Q-H)組。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)，設(shè)置麒麟菜多肽低、中、高劑量分別為2.5、5.0、10.0μg/ml。鋪96孔板，先加入100μl血小板/孔，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，再分別按分組情況加入生理鹽水和麒麟菜多肽10μl孵育30min，最后分別以ADP[6-7]、凝血酶[8-9]誘導(dǎo)，混勻30s，使用FLASH連續(xù)光譜熒光酶標(biāo)儀(405nm波長，50s/次，15min)動(dòng)態(tài)檢測(cè)血小板聚集情況。以PPP作為空白對(duì)照，分別加入10μl ADP、1U凝血酶誘聚劑至PRP，在PRP中透光度改變最大時(shí)即得到血小板最大聚集率(maximun aggregation rate，MAR)，以百分?jǐn)?shù)表示，4h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2.3 麒麟菜多肽對(duì)角叉菜膠引起的小鼠尾部血栓形成的影響 將35只小鼠隨機(jī)分為5組：正常生理鹽水(N)組、麒麟菜多肽低劑量(Q-L1)組、麒麟菜多肽中劑量(Q-M1)組、麒麟菜多肽高劑量(Q-H1)組、氯吡格雷(L)組。根據(jù)文獻(xiàn)[10]并結(jié)合課題組前期實(shí)驗(yàn)，設(shè)置麒麟菜多肽低、中、高劑量分別為15、30、60mg/kg，氯吡格雷100mg/kg。每組動(dòng)物各7只，各組均按0.2ml/10g灌胃給予相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)7d。于末次給藥后1h，各組于小鼠腹腔注射0.2%角叉菜膠0.2ml/10g以誘發(fā)血栓形成。環(huán)境溫度控制在18℃，造模24h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠尾部長度及尾部血栓形成長度，血栓形成長度占尾部總長度百分比即為血栓形成相對(duì)比例(%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)　果

2.1 麒麟菜多肽的制備及純化 麒麟菜樣品的SephdexG-50凝膠層析法洗脫圖譜如圖1所示，多肽成分集中在B峰。用高效液相色譜的方法進(jìn)一步純化收集B峰，獲得麒麟菜多肽，測(cè)試結(jié)果見圖2。SDS-PAGE電泳顯示只有一條區(qū)帶(圖3)，證明理論純度大于90%。

圖1 麒麟菜多肽的SephdexG-50洗脫曲線Fig. 1 The elution curve of samples from Eucheuma in SephdexG-50

圖2 麒麟菜多肽高效液相分離圖譜Fig. 2 Separate map of Eucheuma peptides by HPLC

圖3 麒麟菜多肽SDS-PAGE電泳圖譜Fig. 3 SDS- polyacrylamide gel electrophoresis of peptides from Eucheuma

2.2 比濁法對(duì)聚集的檢測(cè) 由表1可見，在第4個(gè)測(cè)試點(diǎn)時(shí))，血小板達(dá)MAR，2.5、5.0和10.0μg/ml濃度的麒麟菜多肽對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率分別為38.16%、28.96%和39.05%，與生理鹽水組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 麒麟菜多肽抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集的作用(±s，n=6)Tab. 1 Effects of peptide on platelet aggregation induced by ADP in Eucheuma (±s, n=6)

表1 麒麟菜多肽抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集的作用(±s，n=6)Tab. 1 Effects of peptide on platelet aggregation induced by ADP in Eucheuma (±s, n=6)

Group N. Saline treated group; Q-L, Q-M, Q-H group. Platelets in vitro treated with Eucheuma peptide at a dose of 2.5, 5.0, 10.0μg/ml,respectively; MAR. Max aggregation ratio; (1)P＜0.01 compared with Group N

Group　Dose (μg/ml)　MAR(%)　Inhibition (%)N 0 100　0 Q-L　2.5　61.84±3.25(1)　38.16±3.25(1)Q-M　5.0　71.04±2.42(1)　28.96±2.42(1)Q-H　10.0　60.95±2.78(1)　39.05±2.78(1)

由表2可見，在第9個(gè)測(cè)試點(diǎn)時(shí)(8min)，血小板達(dá)到MAR，2.5、5.0和10.0μg/ml麒麟菜多肽對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制率分別為24.66%、30.04%和26.26%，與生理鹽水組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 麒麟菜多肽抗凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集的作用(x±s，n=6)Tab. 2 Effect of peptide on platelet aggregation induced by thrombin in Eucheuma (±s, n=6)

表2 麒麟菜多肽抗凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集的作用(x±s，n=6)Tab. 2 Effect of peptide on platelet aggregation induced by thrombin in Eucheuma (±s, n=6)

Group N. Saline treated group; Q-L, Q-M, Q-H group. Platelets in vitro treated with Eucheuma peptide at a dose of 2.5, 5.0, 10.0μg/ml,respectively; MAR. Max aggregation ratio; (1)P＜0.01 compared with Group N

Group　Dose (μg/ml)　MAR (%)　Inhibition rate (%)N 0 100　0 Q-L　2.5　75.34 ±1.23(1)　24.66 ±1.23(1)Q-M　5.0　69.96 ±1.46(1)　30.04 ±1.46(1)Q-H　10　73.74 ±1.78(1)　26.26±1.78(1)

2.3 麒麟菜多肽對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的影響 由表3可見，15、30和60mg/kg麒麟菜多肽對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成有抑制作用，與生理鹽水組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 麒麟菜多肽對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的作用(±s，n=7)Tab. 3 Effects of peptide on mouse tail thrombosis induced by carrageenan in Eucheuma (±s, n=7)

表3 麒麟菜多肽對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的作用(±s，n=7)Tab. 3 Effects of peptide on mouse tail thrombosis induced by carrageenan in Eucheuma (±s, n=7)

Group N. Saline treated group; Q-L1, Q-M1, Q-H1 group. Mice treated with Eucheuma peptide at a dose of 15, 30, 60 respectively;L group. Mice treated with clopidogrel at a dose of 100mg/kg; (1)P＜0.01 compared with Group N

Group　Dose (mg/kg)　Black tail length/Total length of a tail (%)N 0 63.88±12.04 Q-L1　15　36.89±9.64(1)Q-M1　30　17.25±5.01(1)Q-H1　60　22.99±7.76(1)L 100　18.96±9.17(1)

3 討　論

血栓類疾病復(fù)發(fā)率與致殘率非常高，血栓形成難以監(jiān)測(cè)，目前采用的治療方法有早期預(yù)防、診斷和及時(shí)治療。血小板活化誘導(dǎo)的血栓形成在血栓性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，減少血小板聚集是預(yù)防血栓形成的重要手段。臨床上廣泛應(yīng)用影響血小板活化的藥物來抑制血栓形成。目前，常用的抗血小板聚集藥物有環(huán)氧化酶-1(COX-1)抑制劑、二磷酸腺苷(ADP)受體拮抗劑、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑、血小板激活因子受體拮抗劑、凝血酶和凝血因子(Xa)抑制劑、鈣離子(Ca2+)通道抑制劑等。

血小板聚集是血栓形成的主要過程，是通過血小板表面的受體激活引發(fā)的。這些受體包括凝血酶受體、ADP受體、凝血因子受體等。ADP是體內(nèi)的血小板激活物質(zhì)，通過與血小板膜上ADP受體結(jié)合引起血小板聚集。ADP受體拮抗劑的代表藥物有氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛等[11]。凝血酶受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在凝血酶介導(dǎo)的血小板激活過程中發(fā)揮重要作用[12]。凝血過程中關(guān)鍵因子為一種糖基化蛋白酶Ⅹa因子，其可激活凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，其抑制劑有利伐沙班[13]和阿哌沙班[14]等。

血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是一種膜結(jié)合蛋白，作為纖維蛋白原受體，由α和β兩個(gè)亞單位組成的異二聚體，每個(gè)亞單位都含有胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)。在激活劑作用下，血小板活化并導(dǎo)致血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體的空間構(gòu)象發(fā)生變化，以便與纖維蛋白原或血管病友性因子(vWF)等結(jié)合，從而誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集[15]。ADP、凝血酶、血栓素A2(TXA2)可以活化血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體[16]，血小板通過活化的受體與相鄰血小板配體連接，誘發(fā)聚集，從而形成血栓。目前研究認(rèn)為血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體是誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集的最后共同通路，因此血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑也是防止血栓形成的一個(gè)重要靶點(diǎn)[17]。

氯吡格雷是一種常用的抗血小板藥物，可與血小板膜表面ADP受體結(jié)合，使纖維蛋白原無法與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板相互聚集，但該藥物引起的不良反應(yīng)已陸續(xù)報(bào)道[18]。篩選和研發(fā)選擇性高、作用強(qiáng)、可逆轉(zhuǎn)、不良反應(yīng)小、口服的新型抗血小板聚集藥物是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

麒麟菜(Eucheuma)是一種可食用的海藻，又稱雞腳菜、鹿角菜，盛產(chǎn)于我國海南、廣東、廣西和東南亞等沿海地區(qū)[19]。麒麟菜富含膳食纖維、多糖和礦物質(zhì)，但必需氨基酸和脂肪含量較低，具有活血化瘀的功效[20-21]。光學(xué)比濁法是檢測(cè)血小板功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”[22-23]，本研究也采用此法證實(shí)課題組提取的多肽具有抗血小板聚集活性。角叉菜膠是從海藻中提取的硫酸多糖，可用于制備多種組織炎癥模型，是一種簡便易行的血栓造模試劑，其機(jī)制為由于炎癥損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，在IL-1β的作用下，炎細(xì)胞趨化、浸潤，激活外源性凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血栓形成，并在血栓形成后抑制纖溶系統(tǒng)[24]。

本研究結(jié)果顯示，課題組提取的麒麟菜多肽具有抗ADP和凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集的活性，三種濃度(2.5、5.0、10.0μg/ml)的麒麟菜多肽均能降低ADP和凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集率。此外，我們還通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)麒麟菜多肽能顯著抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠尾部血栓的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麒麟菜多肽可能是通過影響ADP受體、凝血酶受體和Ⅹa因子等作用，抑制血栓形成。麒麟菜多肽是否通過直接抑制ADP受體、凝血酶受體和Ⅹa因子共同途徑(血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體[25])從而抑制血栓形成的分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

總之，麒麟菜來源的多肽分子具有抑制血栓形成的功能，有可能轉(zhuǎn)化成為一種新型的防治血栓形成的藥物，有進(jìn)一步研究開發(fā)的潛力。

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