霍苗苗，程變巧，林偉國(guó)，吳旭瑋

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的病理過(guò)程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等，其中肝纖維化是NAFLD發(fā)展中的關(guān)鍵階段，是向肝硬化發(fā)展的重要病理過(guò)程，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，不僅對(duì)調(diào)節(jié)全身血液循環(huán)起重要作用，還參與組織細(xì)胞炎癥和纖維化的調(diào)節(jié)；研究發(fā)現(xiàn)肝臟亦存在局部RAS，以旁分泌、自分泌的方式發(fā)揮作用，尤其是其經(jīng)典途徑——腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin-converting enzyme-angiotensinⅡ-angiotensin Ⅱ type 1 receptor，ACE-AngⅡ-AT1R)軸與肝纖維化病理生理過(guò)程密切相關(guān)，可能是抗肝纖維化治療的潛在靶點(diǎn)[1]。扶正化瘀方(Fuzhenghuayu decoction，F(xiàn)ZHY)是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，根據(jù)肝纖維化中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)，經(jīng)多年臨床科研實(shí)踐研制開(kāi)發(fā)的抗肝纖維化藥物。前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY可調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)炎癥及與纖維化相關(guān)的基因表達(dá)，阻止非酒精性脂肪性肝纖維化的進(jìn)展[2]。本研究著眼于肝組織せS系統(tǒng)，觀察FZHY對(duì)于NAFLD大鼠ACE-AngⅡ-AT1R軸乃至肝纖維化的影響，以進(jìn)一步探索FZHY減緩肝纖維化進(jìn)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 FZHY藥物組成同扶正化瘀膠囊，扶正化瘀膠囊購(gòu)自上海黃海制藥有限責(zé)任公司(批號(hào)Z20020074)，抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體及抗AT1R抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗ACE抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，Trizol、RNA酶抑制劑、M-MLV(moloney murine leukemia virus)反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶購(gòu)自日本TaKaRa公司，AngⅡ放免試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；引物序列由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI 公司)；Image-Pro plus6.0圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)SD雄性大鼠(150±20g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)40只，正常飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、FZHY低劑量干預(yù)組(低劑量組)和FZHY高劑量干預(yù)組(高劑量組)，每組10只。正常對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其他3組給予高脂飼料(2%膽固醇+10%豬油+88%標(biāo)準(zhǔn)飼料)；喂養(yǎng)24周后，低劑量組、高劑量組給予FZHY水溶液灌胃，低劑量組0.75g/(kg·d)(成人單位體重臨床用量的10倍)，高劑量組1.5g/(kg·d)(成人單位體重臨床用量的20倍)，1次/d，6次/周，共6周，正常組及模型組大鼠以等體積蒸餾水灌胃；繼續(xù)喂養(yǎng)至第30周處死大鼠，取全血和肝組織樣本備用。

1.3 肝功能檢測(cè) 生物化學(xué)分析法測(cè)定各組大鼠血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。

1.4 Ang Ⅱ測(cè)定 各組取血3ml制備血漿，另取100mg肝組織制成肝細(xì)胞勻漿，按Ang Ⅱ放免試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行血漿及肝組織Ang Ⅱ測(cè)定。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查 采用HE和Masson三色膠原染色，光鏡下觀察肝組織病理變化，特別是肝組織脂肪變、炎癥及肝纖維化程度。參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》及《病毒性肝炎防治方案》，進(jìn)行Masson染色圖像分析，每張切片于10倍物鏡下選取四周和中央共5個(gè)區(qū)域，每個(gè)視野包括至少1個(gè)匯管區(qū)或纖維索，以IPP圖文分析軟件系統(tǒng)測(cè)定膠原纖維面積百分比(膠原纖維面積/視野面積×100%)，結(jié)果取均值。

1.6 肝纖維化相關(guān)基因的mRNA水平檢測(cè) 采用RT-qPCR法測(cè)定ACE、AT1R、α-SMA的mRNA水平。Trizol法提取肝組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板行qPCR，以β-actin為內(nèi)參照。ACE(93bp)上游引物：5′-AGTGGGTGCTGCTCTTC CTA-3′，下游引物：5′-CGGAGGCTGTGATGGTTA T-3′；AT1R(205bp)上游引物：5′-CCCTCTGTTCTA CGGCTTTCT-3′，下游引物：5′-CAGTGTGCTTTG AACCTGTCA-3′；α-SMA(160bp)上游引物：5′-CTG ACAGAGGCACCACTGAA-3′，下游引物：5′-CATC TCCAGAGTCCAGCACA- 3′；β-actin(241bp)上游引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，下游引物：5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′。反應(yīng)體系參照TaKaRa公司SYBR Premix ExTaq說(shuō)明書(shū)，并用2–ΔΔCt相對(duì)定量方式分析結(jié)果。ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ΔCt對(duì)照組；當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近時(shí)，2–ΔΔCt表示所檢測(cè)樣品相對(duì)于參比樣品的目的基因的表達(dá)倍數(shù)。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ACE、α-SMA、AT1R蛋白表達(dá)情況 肝組織病理切片依次脫蠟、水化，加3%H2O210min，枸櫞酸鈉修復(fù)液(pH6.0)高壓熱修復(fù)5min，非特異性血清封閉30min，分別加入抗ACE抗體(1∶300)、抗α-SMA抗體(1∶400)、抗AT1R抗體(1∶200)，于4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育20min，DAB顯色2～5min，水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照切片以PBS代替一抗，其余步驟相同。

對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果行半定量分析，圖像采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量目的蛋白陽(yáng)性細(xì)胞積分吸光度(integral absorbance，IA)值，每只大鼠肝組織取5張切片，每張切片分為4個(gè)象限，顯微鏡下每個(gè)象限取1～2個(gè)高倍視野，即每張切片選取4～8個(gè)高倍視野，計(jì)算IA均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)　果

2.1 FZHY對(duì)大鼠血清肝功能的影響 生化分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠血清CHOL、TG水平均明顯升高(P＜0.05)，但3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.16)；同時(shí)，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠血清ALT、AST水平均較正常對(duì)照組升高(P＜0.05)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組ALT、AST均明顯下降，且高劑量組下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

表1 FZHY對(duì)大鼠肝功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of Fuzhenghuayu　decoction on the liver function of rats (±s, n=10)

表1 FZHY對(duì)大鼠肝功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effect of Fuzhenghuayu　decoction on the liver function of rats (±s, n=10)

TC. Total cholesterol; TG. Triacylglycerol; ALT. Alanine aminotransferase; AST. Aspartate aminotransferase; (1)P＜0.05 compared with normal control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with low-dose group

Group　TC (mmol/L)　TG (mmol/L)　ALT (U/L)　AST (U/L)Normal control group　1.88±0.21　0.42±0.08　28.46±6.23　46.35±6.71 Model group　4.73±0.62(1)　1.57±0.24(1)　169.35±17.46(1)　166.91±18.50(1)Low-dose group　4.98±0.72(1)　1.37±0.15(1)　122.18±20.03(1)　131.57±16.34(1)High-dose group　4.65±0.51(1)　1.42±0.29(1)　81.32±16.67(1)(2)(3)　104.28±13.76(1)(2)(3)

2.2 FZHY對(duì)大鼠肝組織病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肝小葉為類(lèi)圓形，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀規(guī)則排列，結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死等病理變化；模型組可見(jiàn)肝組織、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞呈彌漫性大泡性脂肪變，以腺泡3帶明顯，肝小葉內(nèi)點(diǎn)狀或灶狀肝細(xì)胞壞死伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)竇周纖維化改變及匯管區(qū)纖維組織增生，部分出現(xiàn)橋連纖維化；低劑量組、高劑量組可見(jiàn)大鼠肝組織大泡性脂肪變肝細(xì)胞減少，炎癥、纖維化程度明顯改善，其中高劑量組改善效果更明顯(圖1)。

2.3 FZHY對(duì)大鼠肝組織纖維化程度的影響 Mason染色及圖像分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝組織少量膠原纖維表達(dá)(膠原纖維面積比為0.81±0.07)；模型組、低劑量組、高劑量組大鼠肝組織膠原纖維表達(dá)(膠原纖維面積比分別為：21.56±4.18，14.37±3.27，8.56±1.80)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組膠原纖維面積均有所降低，高劑量組下降最明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

2.4 FZHY對(duì)大鼠血漿、肝組織Ang Ⅱ水平的影響血漿Ang Ⅱ水平分析顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組、低劑量組及高劑量組AngⅡ表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、高劑量組肝組織Ang Ⅱ水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組Ang Ⅱ表達(dá)水平均明顯下降，其中高劑量組下降最為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

圖1 大鼠肝組織病理學(xué)變化(×200，n=10)Fig.1 Pathological changes of liver tissue in rats (×200, n=10)

表2 大鼠血漿、肝組織Ang Ⅱ水平變化(±s，n=10)Tab.2 Changes of angiotensin Ⅱ level in rat′s plasma and liver tissue(±s, n=10)

表2 大鼠血漿、肝組織Ang Ⅱ水平變化(±s，n=10)Tab.2 Changes of angiotensin Ⅱ level in rat′s plasma and liver tissue(±s, n=10)

(1)P＜0.05 compared with normal control group; (2)P＜0.05 compared with model group; (3)P＜0.05 compared with low-dose group

Group　Plasma AngⅡ(ng/L)Liver tissue AngⅡ (ng/g)Normal control group　509.0±112.3　926.9±167.3 Model group　873.4±167.3(1)　2451.3±225.8(1)Low-dose group　795.1±187.2(1)　1918.0±179.4(1)(2)High-dose group　832.9±201.4(1)　1662.1±180.2(1)(2)(3)

2.5 FZHY對(duì)大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA mRNA水平的影響 從qPCR反應(yīng)曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)看，擴(kuò)增物均為單一產(chǎn)物，提示質(zhì)控良好。與正常對(duì)照組相比，模型組ACE、AT1R、α-SMA mRNA表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，低劑量組、高劑量組ACE、AT1R、α-SMA mRNA水平下降，高劑量組表達(dá)水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.6 FZHY對(duì)大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達(dá)的影響 ACE免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞周?chē)灰?jiàn)少量棕黃色顆粒沉著，主要分布在肝小葉內(nèi)皮細(xì)胞及中央靜脈周?chē)?，肝?xì)胞內(nèi)未見(jiàn)棕黃色顆粒，模型組肝細(xì)胞周?chē)笃瑺钭攸S色深染，肝細(xì)胞及中央靜脈也可見(jiàn)大量棕黃色著色。AT1R免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肝組織弱陽(yáng)性染色，主要在血管周?chē)磉_(dá)；模型組棕色陽(yáng)性細(xì)胞增多，多見(jiàn)于匯管區(qū)周?chē)?xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、纖維間隙內(nèi)、中央靜脈細(xì)胞。α-SMA免疫組化結(jié)果顯示，正常對(duì)照組血管壁只見(jiàn)少量棕黃色顆粒；模型組血管壁可見(jiàn)小片狀棕黃色顆粒，呈散在分布的棕色染色，陽(yáng)性細(xì)胞多位于匯管區(qū)、肝血竇壁以及纖維間隔。低劑量組及高劑量組大鼠肝細(xì)胞周?chē)攸S色顆粒呈細(xì)小片狀，肝細(xì)胞中亦可見(jiàn)少量棕黃色顆粒(圖3A)。

圖2 大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA mRNA表達(dá)變化Fig.2 Expressions of ACE, AT1R and α-SMA mRNA in liver tissue of rats

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，低劑量組及高劑量組ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯下降，以高劑量組下降程度更為明顯，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3B)。

圖3 大鼠肝組織ACE、AT1R、α-SMA蛋白表達(dá)變化(×400，n=10)Fig.3 Expressions of ACE, AT1R and α-SMA protein in liver tissue of rats (×400, n=10)

3 討　論

肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)病理生理過(guò)程，符合中醫(yī)病機(jī)、病位動(dòng)態(tài)演變的規(guī)律，基于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)整體觀念及辨證論治的傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療肝纖維化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。針對(duì)纖維化、肝硬化“瘀血內(nèi)結(jié)、正氣虛弱”的病機(jī)，F(xiàn)ZHY主要由丹參、人工蟲(chóng)草菌絲、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子組成。方中丹參活血化瘀為君藥；冬蟲(chóng)夏草補(bǔ)虛損、益精氣；桃仁助丹參活血化瘀，共為臣藥；松花粉及絞股藍(lán)同為佐藥，具有益氣潤(rùn)燥、清熱解毒之功效；五味子味酸為引經(jīng)使藥。全方組合，具有扶助正氣、活血祛瘀生新的功效。

肝纖維化源自慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，由于炎癥的反復(fù)發(fā)生與修復(fù)，細(xì)胞外基質(zhì)沉積和代謝失衡可導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)行性加重，進(jìn)而發(fā)生肝硬化，甚至肝衰竭。因此，肝纖維化機(jī)制及有效的抗肝纖維化藥物是近年來(lái)該領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)高脂飼喂成功誘導(dǎo)了輕度非酒精性脂肪性大鼠肝纖維化模型，表現(xiàn)為肝組織HE染色及Masson染色等病理學(xué)方法呈現(xiàn)的肝組織、肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞彌漫性大泡性脂肪變，竇周纖維化改變及匯管區(qū)纖維組織增生，部分出現(xiàn)橋連纖維化；通過(guò)qPCR及免疫組織化學(xué)染色法可見(jiàn)模型動(dòng)物肝臟α-SMAmRNA及蛋白水平明顯升高。α-SMA被認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化標(biāo)志物；目前大量研究證實(shí)[2-4]，肝纖維化發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用的中心環(huán)節(jié)是HSCs活化增殖，活化的HSCs高度表達(dá)α-SMA并合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)展，因此如何有效抑制HSCs活化增殖是治療肝纖維化的關(guān)鍵問(wèn)題。

Paizis等[1]首次證實(shí)肝臟亦存在局部RAS，肝臟局部RAS與肝纖維化、肝硬化有著密切的關(guān)系，其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究同樣證實(shí)，肝纖維化模型組せS中ACE、Ang Ⅱ、AT1R各環(huán)節(jié)表達(dá)均明顯升高，ACE有效催化Ang Ⅰ生成活性分子Ang Ⅱ，主要通過(guò)AT1R發(fā)揮經(jīng)典的ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸效應(yīng)從而促進(jìn)肝纖維化的形成。研究表明，ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸與HSCs活化增殖密切相關(guān)[5]。Ang Ⅱ是RAS中最為重要的活性物質(zhì)之一，在肝纖維化的過(guò)程中發(fā)揮著促氧化、促炎及促纖維化的作用。肝纖維化患者及肝纖維化模型鼠血清中Ang Ⅱ水平均明顯升高[1]。Ang Ⅱ與肝細(xì)胞上的AT1R結(jié)合，促進(jìn)肝臟細(xì)胞外基質(zhì)增生，誘導(dǎo)HSCs活化、收縮、增殖與遷移，啟動(dòng)肝纖維化進(jìn)程；活化的HSCs又可以增加RAS通路中各因子的表達(dá)，從而促進(jìn)炎癥、Ang Ⅱ的氧化效應(yīng)及纖維化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。Bataller等[6-7]通過(guò)皮下植入微型滲透壓泵進(jìn)行慢性Ang Ⅱ輸注證實(shí)，Ang Ⅱ可以誘導(dǎo)HSCs的激活及膠原合成的增加；Ang Ⅱ促進(jìn)體外培養(yǎng)的HSCs活性氧的生成、細(xì)胞的增殖和促炎癥因子的分泌。經(jīng)典RAS干預(yù)藥物血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACE inhibitor，ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ receptor blockage，ARB)均可緩解肝纖維化模型動(dòng)物的疾病進(jìn)展[8-10]。

以上研究均證實(shí)ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸通過(guò)影響HSCs的活化調(diào)控肝纖維化進(jìn)展；而扶正化瘀藥物組肝纖維化程度較模型組明顯減輕，RAS中ACE、Ang Ⅱ、AT1R各環(huán)節(jié)及α-SMA表達(dá)均明顯降低，提示FZHY能有效延緩非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，該機(jī)制考慮與抑制ACE-Ang Ⅱ-AT1R軸活性從而有效抑制HSCs進(jìn)展密切相關(guān)。綜上所述，本研究為傳統(tǒng)中藥FZHY在臨床用于非酒精性脂肪性肝纖維化的治療提供了理論依據(jù)。

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