賈慧 王魯文 桑慶娜 聶讓讓 候亞楠 夏小飛 宋易坤

尿失禁即膀胱內(nèi)的尿不能控制而自行流出，較為常見，中老年女性是尿失禁的高發(fā)人群，其發(fā)病率已超過高血壓、抑郁癥和糖尿病等常見疾病[1]。該病的主要癥狀是尿液自行流出，可分為混合性尿失禁、急迫性尿失禁和壓力性尿失禁3種類型。其中 SUI是指當(dāng)用力、咳嗽或打噴嚏等腹壓增高時(shí)有尿液漏出[2]。SUI是尿失禁最常見的類型，約占尿失禁構(gòu)成比的一半左右[3]；該病不僅影響患者下尿路的正常功能，還會(huì)對患者的心理造成極大的負(fù)面影響，導(dǎo)致患者生活品質(zhì)急劇下降，甚至無法正常生活。SUI是一種多因子疾病，其發(fā)病率與患者年齡、病史、妊娠史、雌激素水平、遺傳等多個(gè)因素相關(guān)，而引起SUI的直接原因目前尚無定論。本研究通過檢測凋亡相關(guān)基因蛋白BAK、cFLIP在尿道周圍肌組織中的表達(dá)情況，探討SUI與BAK、cFLIP之間的關(guān)系，為該病的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2016年12月～2017年3月我院婦科收治的SUI患者20例作為觀察組，所有患者均已停經(jīng)。在手術(shù)過程中，取患者12點(diǎn)方位1.0cm×1.0cm陰道壁全層組織，其中POP-Q 評分<Ⅱ度（單純SUI組）15例，POP-Q評分≥Ⅱ度（SUI+POP組）5例。選擇同期因子宮肌瘤、卵巢良性腫瘤、CIN等除惡性腫瘤外婦科疾病住院，已停經(jīng)但無POP或SUI患者20例（POP-Q 評分<Ⅱ度）作為對照組，取患者陰道前壁12點(diǎn)方位大小約1.0cm×1.0cm全層組織標(biāo)本。所有患者術(shù)前對本研究均知情同意；患者近半年未服用激素類藥物，未行盆底手術(shù)，無急性炎癥病史，排除惡性腫瘤疾病。各組患者年齡、妊娠史、BMI比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表 1。

表1 各組患者一般資料對比（±s）

表1 各組患者一般資料對比（±s）

組別例數(shù)年齡（歲）孕次產(chǎn)次BMI（kg/m2）SUI組 1544.60±6.584.20±1.482.40±0.5427.60±1.51 SUI+POP組 552.66±3.784.00±1.002.33±0.5729.66±2.08對照組 2050.00±6.514.38±0.832.20±0.4428.00±2.12

1.2 標(biāo)本處理患者的標(biāo)本采集自同一部位，大小相同，但保存方式有所不同。用于行免疫組化檢測的標(biāo)本放入甲醛溶液中進(jìn)行固定，濃度為10%，隨后用石蠟將其包埋，經(jīng)過切片、染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并篩選；用于行qRT-PCR檢測的標(biāo)本直接放入液氮冷凍，并于-80℃環(huán)境中保存。

1.3 免疫組化SP法檢測BAK、cFLIP蛋白的表達(dá)BAK多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，cFLIP多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，所有試劑采購自中山金橋生物技術(shù)有限公司，檢測各組標(biāo)本中BAK、cFLIP表達(dá)時(shí)均采用SP二步法，按照操作規(guī)范進(jìn)行操作。用電磁爐對切片進(jìn)行處理，切片脫蠟水化后，用pH值為6.0、濃度為0.01mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液連續(xù)修復(fù)20min。為阻斷過氧化物酶，需采用濃度為0.3%的過氧化氫，隨后用山羊血清封閉標(biāo)本，并進(jìn)行孵育。使標(biāo)本在4℃的環(huán)境下過夜，隨后向標(biāo)本中添加二抗及鏈霉素-過氧化物酶，經(jīng)過顯色和復(fù)染后才能封片。用已知子宮內(nèi)膜陽性切片做BAK、cFLIP陽性對照；以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。BAK、cFLIP蛋白經(jīng)染色后呈現(xiàn)出顆粒狀，以黃色為主，也有部分棕褐色。細(xì)胞漿表達(dá)出來的信號大多數(shù)為陽性信號，觀察細(xì)胞時(shí)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，視野倍數(shù)為400倍，根據(jù)標(biāo)本的陽性細(xì)胞和染色強(qiáng)度對其進(jìn)行定量處理。按照顏色的深淺進(jìn)行強(qiáng)度評分，分值為0～3分，0分表示基本不著色，1分表示顯色為淡黃色，2分表示顯色為棕黃色，3分表示顯色為棕褐色。按照陽性細(xì)胞數(shù)量的多少進(jìn)行評分，分值為0～3分，0分表示陽性細(xì)胞占比<5%，1分表示陽性細(xì)胞占比≥5%且＜20%，2分表示陽性細(xì)胞占比≥20%且＜50%，3分表示陽性細(xì)胞占比為≥50%。兩種評分得 分 相 加，0～1分（-），2分（+），3～4分（++），5～6分（+++）。

1.4 qRT-PCR法檢測BAK、cFLIP的表達(dá)Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Master Mix均購自美國GeneCopoeia公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，生物分光光度儀為美國Thermo公司產(chǎn)品，Applied Biosystems Plus One型qRT-PCR儀為美國GeneCopoeia公司產(chǎn)品。RNA提取和檢測：首先將患者的陰道前壁組織在液氮環(huán)境中進(jìn)行研磨，直至陰道前壁組織變成粉狀為止，然后用RNA提取試劑從該組織中提取RNA，并檢測RNA的濃度，所需工具為紫外分光光度計(jì)。細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：根據(jù)說明書中的方法，將總RNA在37℃下經(jīng)過1h的孵育逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，從原來的 1μl變成 10μl。PCR反應(yīng)：以GAPDH 作為內(nèi)參，GAPDH上游引物序列為：5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'，下游引物序列為：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA- 3'；BAK的上游引物序列為：5'-ATGGTCACCTTAC CTCTGCAA-3'，下游引物序列為：5'-TCATAGCGTCGG TTGATGTCG-3'； cFLIP的上游引物序列為：5'-GAGCAAGCCCCTAGGAATCT-3'，下游引物序列為5'-GGCAGAAACTCTGCTGTTCC-3'。取 cDNA 1μl，總反應(yīng)容量為 20μl，反應(yīng)持續(xù) 15min，在95℃的環(huán)境下進(jìn)行，循環(huán)總量為40個(gè)。分析結(jié)果時(shí)，采用Ct值法，直接取2-ΔCt 。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用組間LSD檢驗(yàn)、單因素方差分析。陰道前壁組織中BAK和cFLIP表達(dá)水平的關(guān)系分析采用Pearson分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組BAK和cFLIP的表達(dá)免疫組化法檢測結(jié)果顯示，陰道前壁組織中的BAK和 cFLIP主要定位于細(xì)胞漿。BAK的表達(dá)情況：觀察組樣本中發(fā)現(xiàn)顏色較深、黃色的陽性細(xì)胞且分布相對密集，明顯高于背景顏色，對照組中細(xì)胞著色為淡黃色至黃色，表達(dá)低下，分布稀疏，呈低表達(dá)狀態(tài)；cFLIP蛋白則相反，見圖1。SUI組、SUI+POP組分別與對照組比較，BAK和cFLIP的陽性表達(dá)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而 SUI組與 SUI+POP組比較，BAK和cFLIP的陽性表達(dá)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。各組BAK和cFLIP陽性表達(dá)情況見表2。

表2 各組BAK和cFLIP陽性表達(dá)情況[n（%）]

2.2 各組qRT-PCR檢測結(jié)果qRT-PCR檢測BAK、cFLIP表達(dá)水平顯示，SUI組和SUI+POP組分別與對照組比較，BAK和cFLIP表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而 SUI組與 SUI+POP組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組BAK和cFLIP基因表達(dá)量見表3。

表3 各組BAK和cFLIP的mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表3 各組BAK和cFLIP的mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與SUI+POP組比較，aP=0.606、0.650；與對照組比較，bP=0.000、0.010；與對照組比較，cP=0.000、0.020

組別 n BAK表達(dá)量 cFLIP表達(dá)量SUI組 15 0.0045±0.0042ab0.0012±0.0011ab SUI+POP組 5 0.0048±0.0045c0.0010±0.0011c對照組 20 0.0011±0.0009 0.0056±0.0048

2.3 BAK和cFLIP在陰道前壁組織中表達(dá)的相關(guān)性BAK和cFLIP在陰道前壁組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.211，P<0.05）。

圖1 免疫組化顯示BAK、cFLIP在各組中的表達(dá)情況（SP，×400）

3 討論

從本質(zhì)上來說，細(xì)胞凋亡是一個(gè)自然的過程，有利于維持組織的正常形態(tài)，在維持器官正常功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但過量的細(xì)胞凋亡則十分有害，它可能會(huì)引發(fā)各種惡性疾病，如惡性貧血、神經(jīng)類疾病，甚至是艾滋病。為有效抑制細(xì)胞的持續(xù)凋亡，必須盡可能減少死亡配體受體的數(shù)量或抑制Caspase活性。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷進(jìn)步及相關(guān)研究的進(jìn)一步深入，由平滑肌損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡報(bào)道較多[4，5]。事實(shí)上，平滑肌是一個(gè)力學(xué)結(jié)構(gòu)，它與人體陰道前壁的性能密切相關(guān)，甚至決定了陰道的功能[6]。了解平滑肌和纖維組織細(xì)胞凋亡的生物特性有助于制定新的治療策略。

BAK是Bcl-2家族中的一員，存在于染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，BAK長度約為6kb，外顯子至少有3個(gè)。BH1、BH2、BH3分別是BAK不同的功能區(qū)域。BAK基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理為：BAK的兩個(gè)功能區(qū)域和Bcl-2結(jié)合，形成了新的二聚體，使得Bcl-2原本的作用有所減弱，而抑制細(xì)胞凋亡活性是Bcl-2的主要功能。隨后，BAK的另外一個(gè)功能區(qū)域，即BH3將會(huì)發(fā)揮作用增強(qiáng)的角色，其主要作用是激活人體中的半胱氨酸蛋白酶，加速細(xì)胞凋亡[7]。由此可見，BAK參與了細(xì)胞凋亡的整個(gè)過程[8]。

cFLIP同樣位于人體染色體上，cFLIP的信使RNA有很多種亞型。然而，在基因表達(dá)過程中，呈現(xiàn)出來的亞型僅有兩種，一種是短型的cFLIPs，另一種則是長型的cFLIP1[9]。從結(jié)構(gòu)上看，cFLIP和Caspase-8有較多的相似之處。因此，在與DED結(jié)合的過程中，cFLIP也在和Caspase-8競爭，它可以阻止DISC形成，而DISC的主要作用是阻斷細(xì)胞死亡。就目前而言，F(xiàn)as-FasL凋亡途徑較為清晰[10]。

無論BAK蛋白還是cFLIP蛋白，其參與凋亡過程都與半胱氨酸蛋白酶有關(guān)。事實(shí)上，半胱氨酸蛋白酶是一種蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。功能區(qū)域與Bcl-2的結(jié)合首先會(huì)形成新的二聚體，繼而使半胱氨酸蛋白酶重新被激活。一旦半胱氨酸蛋白酶被激活，就會(huì)進(jìn)行胞質(zhì)重組、染色質(zhì)凝集等一系列活動(dòng)，從而加速細(xì)胞凋亡。從結(jié)構(gòu)上看，cFLIP蛋白和Caspase-8有較多相似之處，因此，cFLIP蛋白可以阻止誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的復(fù)合體形成，從而降低細(xì)胞凋亡的速度。

有研究表明， 細(xì)胞凋亡是引起SUI的主要因素之一[11]。隨著年齡的不斷增長，女性橫紋肌細(xì)胞將會(huì)不斷減少，取而代之的是一些結(jié)締組織或脂肪組織。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，雌激素降低可能為細(xì)胞凋亡的直接誘因，通過觀察大鼠陰道上皮細(xì)胞可知，上皮細(xì)胞的雌激素水平并不是固定不變的，而是隨著月經(jīng)周期的時(shí)間而發(fā)生改變。因此，在不同時(shí)期，細(xì)胞凋亡率也會(huì)有所不同。事實(shí)表明，月經(jīng)期間的細(xì)胞凋亡率較低，但是月經(jīng)結(jié)束后，細(xì)胞凋亡率就會(huì)隨之上升。一般來說，由于雌激素水平下降而引起的細(xì)胞凋亡常見于尿道上皮細(xì)胞，它不會(huì)對其它細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，尿道周圍肌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象普遍存在，BAK與cFLIP在尿道前壁組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，尿道周圍平滑肌和纖維組織中BAK表達(dá)增加可能參與了壓力性尿失禁發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，抑制BAK表達(dá)可能為診治壓力性尿失禁提供新的思路。然而，尿道下組織和上皮細(xì)胞的凋亡過程是否一致，雌激素水平的變化規(guī)律是否相同，仍有待證實(shí)。

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