陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所, 杭州 310053)

1 背景

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是冠心病和腦卒中發(fā)生的主要病因。高血脂、高血糖、肥胖、高血壓和高胰島素血癥等胰島素抵抗引起的代謝綜合征的各種臨床表象均為AS的重要危險(xiǎn)因素[1,2]。人類(lèi)AS的發(fā)病模式多種多樣，在高血脂環(huán)境下，有肥胖導(dǎo)致胰島素抵抗、共同促進(jìn)AS形成，也有胰島素抵抗導(dǎo)致高血壓、加速AS形成，往往同時(shí)存在代謝綜合的一種或多種臨床表象，其發(fā)生與發(fā)展是多因素、多步驟的，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[3,4]。流行病學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，AS的形成與生物學(xué)因素如肥胖、血壓、血糖升高、血脂異常等[5]，心理因素包括個(gè)性特征(A型或D型人格)[6]和情緒異常(焦慮、抑郁)等[7]、以及家族史等[8]有很大的關(guān)系。因此, 研究和建立多基因、多靶點(diǎn)、多層次的動(dòng)物模型對(duì)疾病的病理機(jī)制和治療藥物研究具有非常重要意義。

豬在循環(huán)系統(tǒng)、血小板凝聚系統(tǒng)、脂蛋白代謝及消化系統(tǒng)均與人類(lèi)極為相似，其AS病變可見(jiàn)于腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈大分支，與人類(lèi)AS病變的分布特點(diǎn)相一致，病理學(xué)檢測(cè)亦表明，豬AS斑塊具有人類(lèi)成熟斑塊的特點(diǎn)，且小型豬過(guò)度緊張或興奮等刺激會(huì)促發(fā)AS、心肌梗死等心血管疾病[9,10]，已成為研究心血管疾病的病理機(jī)制和治療藥物療效研究的一個(gè)重要模型。國(guó)外有一些特殊品系，如Yucatan、G?ttingen、Ossabaw小型豬等，在高脂飼養(yǎng)環(huán)境下，除出現(xiàn)高脂血癥外，可自發(fā)肥胖、糖尿病、高血壓和AS等，具有獨(dú)特的應(yīng)用特點(diǎn)和價(jià)值，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的研究[11-13]。我國(guó)小型豬種質(zhì)資源豐富，如常用的巴馬小型豬、五指山小型豬、貴州香豬、中國(guó)農(nóng)大小型豬、西藏小型豬等等，但由于缺乏對(duì)其生物學(xué)功能和醫(yī)學(xué)用途的研究，各品系在心血管疾病研究的應(yīng)用生理特點(diǎn)均不清楚，使用時(shí)缺少選擇性和針對(duì)性。在AS研究中，較早且常用的巴馬小型豬, 用高脂環(huán)境誘導(dǎo)AS的形成往往造模周期過(guò)長(zhǎng), 除老年豬外，一般需9～12個(gè)月以上。因此，許多研究者[14,15]采用球囊損傷血管加高脂飼喂或縮管環(huán)手術(shù)致冠脈狹窄或藥物誘導(dǎo)加高脂飼喂致AS形成，以求縮短造模時(shí)間，但這些手術(shù)誘發(fā)因素與臨床AS的發(fā)生和病因存在一定的差異，且這些誘導(dǎo)方法均未考慮冠心病的遺傳異質(zhì)性和心理因素。為此，研究者[16]一方面通過(guò)提高飼料中的脂肪含量，同時(shí)添加動(dòng)物油和植物油，改善飼料的適口性，研制合適的高脂飼料配方，在不同的小型豬品系上進(jìn)行嘗試，另一方面進(jìn)行生理和遺傳學(xué)特性的研究，以尋找在高脂飼養(yǎng)環(huán)境下能自發(fā)心血管疾病或有遺傳易感性的品系。我們前期研究表明[17,18]，五指山小型豬和西藏小型豬在高脂環(huán)境下易形成AS，且同時(shí)并存如肥胖、高血脂、高血壓、胰島素抵抗等多種AS危險(xiǎn)因素，本文將我們的研究工作作一回顧，為在心血管疾病領(lǐng)域研究中的選擇和應(yīng)用提供參考。

2 生理特點(diǎn)

前期研究在對(duì)五指山小型豬和西藏小型豬生活習(xí)性觀察中顯示[19], 五指山小型豬膽小, 易激動(dòng), 性格暴躁、易攻擊實(shí)驗(yàn)者, 常表現(xiàn)出恐懼、敵意的姿勢(shì), 對(duì)應(yīng)激敏感。在長(zhǎng)途運(yùn)輸后, 應(yīng)激反應(yīng)明顯。而西藏小型豬則性情溫順, 對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng), 不易應(yīng)激, 在長(zhǎng)途運(yùn)輸后, 應(yīng)激反應(yīng)相對(duì)較小, 且易恢復(fù), 對(duì)實(shí)驗(yàn)者也無(wú)攻擊性。在高脂環(huán)境下, 五指山小型豬和西藏小型豬均易形成AS, 且并存多種AS形成的危險(xiǎn)因素, 但其發(fā)病癥狀和臨床表現(xiàn)各有特點(diǎn)。

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激

運(yùn)輸應(yīng)激可釋放皮質(zhì)醇、抑制抗體反應(yīng)和細(xì)胞吞噬功能, 從而導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制, 而皮質(zhì)醇是應(yīng)激的終產(chǎn)物[20]。我們[19]研究表明，五指山小型豬和西藏小型豬在運(yùn)輸超過(guò)4 h后均出現(xiàn)明顯的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為在運(yùn)輸應(yīng)激后皮質(zhì)醇(CORT) 和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)明顯升高，且五指山小型豬的變化幅度相對(duì)較大。在恢復(fù)飼養(yǎng)14 d起明顯降低，至28～42 d時(shí)處于穩(wěn)態(tài)。運(yùn)輸后五指山小型豬和西藏小型豬的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)指標(biāo)均顯著升高。同時(shí), 白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(%NEUT)和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞(N/L)比值增加，淋巴細(xì)胞百分比(%LYM)減少。長(zhǎng)途運(yùn)輸后，小型豬的血?dú)怆娊赓|(zhì)也發(fā)生變化，且五指山小型豬運(yùn)輸應(yīng)激后血?dú)怆娊赓|(zhì)的變化幅度較為明顯，在適應(yīng)恢復(fù)35～42 d時(shí)pH和HCO3-仍明顯降低。西藏小型豬需經(jīng)過(guò)適應(yīng)恢復(fù)期28 d以上后血液生理指標(biāo)變化達(dá)到穩(wěn)態(tài)，而五指山小型豬對(duì)應(yīng)激反應(yīng)較為敏感，且需要相對(duì)較長(zhǎng)的恢復(fù)期。

2.2 對(duì)外源性脂肪的敏感性

五指山小型豬和西藏小型豬靜脈注射脂肪乳，對(duì)甘油三酯(TG)敏感，脂耐量值西藏小型豬大于五指山小型豬，而高脂飼料飼喂對(duì)總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)敏感，脂耐量值五指山小型豬大于西藏小型豬，五指山小型豬對(duì)TC和TG水平的清除相對(duì)較慢，且冠心病危險(xiǎn)因子水平TC/HDL-C和LDL-C/HDL-C 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西藏小型豬[21]，可見(jiàn)，五指山小型豬和西藏小型豬的血脂代謝水平在脂肪乳或高脂誘導(dǎo)后顯示出不同的變化規(guī)律。

3 AS形成的病癥特點(diǎn)

用高脂誘導(dǎo)五指山小型豬和西藏小型豬均可建立高脂血癥或AS模型，與其它品系的小型豬比，五指山小型豬和西藏小型豬在高脂環(huán)境下AS形成較快, 一般高脂飼喂16周時(shí) AS開(kāi)始形成, 至24周后AS的病變嚴(yán)重，斑塊成熟，主要分布于腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈。且五指山小型豬和西藏小型豬在AS形成過(guò)程中，除高血脂外，同時(shí)還并存肥胖、高血壓、炎癥及胰島素抵抗等多種臨床癥狀，這與人類(lèi)的臨床表現(xiàn)極為相似。

3.1 高血脂與肥胖

在高脂飼料飼喂下，五指山小型豬血脂上升快且能保持穩(wěn)定的高水平狀態(tài)[22]，呈現(xiàn)嚴(yán)重的高脂血癥，而同樣的高脂飼料配方進(jìn)行飼喂，西藏小型豬的血脂水平前期上升幅度較快而后期相對(duì)較低[23]，但西藏小型豬的動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積和AS病變?nèi)院車(chē)?yán)重，斑塊成熟。在同樣配方的高脂飼料和同樣的環(huán)境下飼養(yǎng)，五指山小型豬體質(zhì)量迅速增加并出現(xiàn)重度肥胖，體型大而圓，皮下脂肪大量沉積，而西藏小型豬雖體質(zhì)量增加但外觀壯而不肥，體型瘦長(zhǎng), 內(nèi)臟脂肪沉積較多，提示五指山小型豬屬外周型肥胖，而西藏小型豬屬中心型內(nèi)臟肥胖。

3.2 炎癥反應(yīng)

西藏小型豬對(duì)高脂誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相對(duì)敏感，在高脂飼喂2周后出現(xiàn), 表現(xiàn)為單核細(xì)胞(MONO)、WBC和NEUT明顯上升，血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)明顯升高，且呈持續(xù)的炎癥反應(yīng)，在高脂飼喂24周后，炎癥程度更為嚴(yán)重。而五指山小型豬初期呈現(xiàn)出低度炎癥，表現(xiàn)為單核細(xì)胞升高和血清CRP、IL-6，TNF-α明顯上升，但其升高幅度低于西藏小型豬, 在高脂飼喂24周后五指山小型豬出現(xiàn)中度炎癥。五指山小型豬和西藏小型豬的腹主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈血管斑塊中血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、單核細(xì)胞趨附因子 -1(MCP-1)和核因子 -κB(NF-κB) p65和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)均大量表達(dá), 與五指山小型豬相比，西藏小型豬血管斑塊中VCAM-1、ICAM-1、MCP-1和NF-κB p65和VEGF的表達(dá)更為強(qiáng)烈。

3.3 高血壓和胰島素抵抗

我們課題組前期研究表明[18,23], 高脂環(huán)境下西藏小型豬可自發(fā)高血壓，而五指山小型豬血壓略有上升，但不及西藏小型豬，這兩種小型豬在不同時(shí)間段發(fā)生糖耐量異常和高胰島素血癥，但空腹血糖均在正常范圍, 且未見(jiàn)明顯的多飲、多尿、體質(zhì)量降低等糖尿病表征，這與人類(lèi)的糖尿病前期即胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)類(lèi)似。西藏小型豬在高脂誘導(dǎo)4周后即可出現(xiàn)高胰島素血癥、8周后糖耐量減低、12周后高血壓形成。而五指山小型豬則在高脂誘導(dǎo)8周后出現(xiàn)高胰島素抵抗指數(shù)升高, 20周后有顯著性差異、24周時(shí)出現(xiàn)糖耐量異常。這與Yucatan、G?ttingen等小型豬特性十分相似[11,12]。這些代謝綜合征的臨床表象提示，五指山小型豬和西藏小型豬AS的發(fā)病特點(diǎn)很符合人類(lèi)以胰島素抵抗為病理基礎(chǔ)的多靶點(diǎn)AS發(fā)病特點(diǎn)[12,24]，在心血管疾病研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。大體解剖還顯示，西藏小型豬的胰腺指數(shù)較小，而血清胰島素水平明顯高于五指山小型豬; 同時(shí)顯示，五指山小型豬肝臟和皮下組織脂肪沉積較多，而西藏小型豬則在心臟、腎臟組織脂肪沉積較多，西藏小型豬可能適合于研究中心型胰島素抵抗的心血管疾病模型，而五指山小型豬適合于研究外周胰島素抵抗的疾病模型。

4 AS形成相關(guān)血脂和炎癥易感基因

AS的發(fā)生與發(fā)展是多因素、多步驟的, 是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，不同個(gè)體在相同環(huán)境下, 其易感性存在差異。血脂異常與炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生過(guò)程中起重要作用, 西藏小型豬和五指山小型豬在AS形成相關(guān)的血脂和炎癥易感基因的敏感性方面存在明顯的異質(zhì)性。

4.1 AS形成相關(guān)的血脂易感基因

我們的研究[25]表明，經(jīng)高脂誘導(dǎo)24周后，五指山小型豬和西藏小型豬肝臟組織中載脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、脂蛋白酯酶(LPL)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)、載脂蛋白B(ApoB)、載脂蛋白AV(ApoAⅤ)和三磷酸腺苷結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ABCA1)的基因表達(dá)均有不同程度的改變，提示這些基因在高脂誘導(dǎo)而導(dǎo)致小型豬代謝紊亂過(guò)程中起重要作用，但不同品系的小型豬對(duì)這些基因的敏感性不同，五指山小型豬的LDLR和PCSK9基因?qū)Ω咧T導(dǎo)非常敏感，而西藏小型豬的ApoB、LPL及ABCA1等基因?qū)Ω咧T導(dǎo)的敏感性極高。

4.2 AS形成相關(guān)的炎癥易感基因

高脂飼喂24周后, 五指山小型豬、西藏小型豬外周血中T淋巴細(xì)胞亞群CD134 (OX40)、OX40配體(OX40L)、5脂氧合酶(5-LO)、5脂氧合酶激活蛋白(FLAP)、ICAM-1、VCAM-1和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)均有不同程度的升高, 這些基因在小型豬中的表達(dá)與人類(lèi)極為相似，但不同品系的小型豬的表達(dá)程度不同, 五指山小型豬的5-LO、FLAP基因較為敏感，而西藏小型豬ICAM-1、VCAM-1和MMP-9基因的敏感性較高[25]，這些結(jié)果提示，5-LO信號(hào)通路激活可能是五指山小型豬在高脂誘導(dǎo)后加速白三烯形成進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的主要途徑，而西藏小型豬高脂誘導(dǎo)致炎癥反應(yīng)是白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附及粥樣斑塊易于破裂方面起主導(dǎo)作用，適合于斑塊易損的機(jī)制研究。

5 值得探討的問(wèn)題

五指山小型豬、西藏小型豬尤如2個(gè)不同類(lèi)型的AS易感群體，而我們對(duì)五指山小型豬、西藏小型豬的研究仍限于特定的高脂環(huán)境下，這些研究結(jié)果可能對(duì)研究者在心血管疾病中對(duì)小型豬品系的選擇和應(yīng)用有一定的參考。但在人類(lèi)的飲食習(xí)慣中，除高脂飲食外，還有高糖飲食、高鹽飲食以及飲酒等習(xí)慣，且往往是高糖、高脂、高鹽等多種結(jié)合的飲食，在這些多因素的飲食環(huán)境下，五指山小型豬、西藏小型豬可能會(huì)出現(xiàn)更多的心血管疾病的表現(xiàn)。另一方面，大量研究證實(shí)，腸道微生物在食物營(yíng)養(yǎng)和健康中起著重要的作用[26]，腸道菌群可通過(guò)影響胃腸道激素的分泌調(diào)控代謝過(guò)程[27]，還可通過(guò)影響膽汁酸代謝而引起膽固醇的代謝紊亂進(jìn)而促發(fā)AS[25,28]。目前我們僅觀察研究五指山小型豬、西藏小型豬在高脂環(huán)境下的AS發(fā)病特征，但除五指山小型豬、西藏小型豬本身的遺傳因素外，高脂環(huán)境可能與小型豬腸道菌群的種類(lèi)結(jié)構(gòu)或改變腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)，這些問(wèn)題都值得進(jìn)一步探討。