余秋鋒

隨著人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，玻璃化凍融胚胎移植在提高患者累積妊娠率的同時(shí)還能預(yù)防重度卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生，有效提升生殖助孕質(zhì)量[1，2]，然而凍融胚胎的移植結(jié)局與女方年齡、子宮內(nèi)膜容受性、解凍復(fù)蘇后胚胎質(zhì)量等息息相關(guān)[3，4]。根據(jù)凍融胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間的長短不同，可觀察提前半天解凍后移植與當(dāng)天解凍當(dāng)天移植的優(yōu)劣，同時(shí)觀察提前半天解凍胚胎生長發(fā)育情況是否能有效預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局。本研究回顧性分析我中心2015年1月～2017年7月562個(gè)卵裂期胚胎凍融移植周期，探討培養(yǎng)時(shí)間長短對(duì)胚胎復(fù)蘇后妊娠結(jié)局的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析我中心2015年1月～2017年7月562個(gè)卵裂期FET周期，女方平均年齡（33.86±5.19）歲，平均子宮內(nèi)膜厚度（9.68±1.95） mm，平均移植胚胎（2.13±0.33）枚。均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：均為第一個(gè)凍融移植周期且移植胚胎數(shù)≥2；不孕因素包括女方盆腔輸卵管排卵障礙等，男方少、弱、畸精、無精癥等；排除新鮮胚胎和凍融胚胎一起移植或卵裂胚和囊胚分步移植的患者及女方子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔積液、粘連等影響著床的因素。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎冷凍解凍 ①冷凍標(biāo)準(zhǔn)：參照以前本中心裂期評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]并結(jié)合目前實(shí)際作修改：其中7～9細(xì)胞，Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，4細(xì)胞以上，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)胚胎為可用胚胎，結(jié)合患者意愿選擇性將D3天4～6細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎及6細(xì)胞以上Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)胚胎用于冷凍或部分冷凍后養(yǎng)囊胚。②冷凍過程：使用冷凍液（Vitrolife，瑞典），按使用說明書結(jié)合本中心實(shí)際冷凍卵裂胚，卵裂胚冷凍在37℃于1號(hào)液中放置5～10min，轉(zhuǎn)移至2號(hào)液放置2min后轉(zhuǎn)移至3號(hào)液并于30s內(nèi)裝入載桿并投入液氮中。③解凍過程：使用解凍液（Vitrolife，瑞典），按使用說明書結(jié)合本中心實(shí)際解凍卵裂胚或囊胚。卵裂胚解凍在37℃條件下迅速放入1號(hào)液，30s內(nèi)迅速轉(zhuǎn)移至2號(hào)液1min，然后轉(zhuǎn)移至3號(hào)液2min，再轉(zhuǎn)入4號(hào)液5min，最后轉(zhuǎn)移至預(yù)先平衡好的囊胚培養(yǎng)皿于倒置顯微鏡下觀察復(fù)蘇后胚胎的存活情況，有一半以上卵裂球存活者視為復(fù)蘇存活并可用于移植。

1.2.2 分組 按體外培養(yǎng)時(shí)間不同分為提前解凍組（A組，n=478）和當(dāng)日解凍組（B組，n=84）。提前解凍組為移植前一天下午解凍，培養(yǎng)18～20h后移植；當(dāng)日解凍組為當(dāng)日解凍后培養(yǎng)2～4h后移植。根據(jù)解凍后卵裂球增殖與否將A組分為3組：A1組（n=321）均增殖，A2組（n=131）部分增殖，A3組（n=26）不增殖；再根據(jù)卵裂球增殖數(shù)目將有增殖胚胎周期分為Aa組（n=184）至少有一個(gè)融合胚胎，Ab組（n=268）無融合胚胎。

1.2.3 內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及移植 包括自然周期、人工周期和促排周期。自然周期適用于月經(jīng)規(guī)律、有排卵的患者，于月經(jīng)周期的第8～10天來生殖中心行B超監(jiān)測(cè)，主導(dǎo)卵泡直徑14mm時(shí)開始每日或隔日行B超檢查并監(jiān)測(cè)LH峰，排卵后2～4d或LH峰出現(xiàn)后4～5d進(jìn)行卵裂期胚胎移植；月經(jīng)不規(guī)律或自然周期內(nèi)膜生長不理想者采用人工周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，即于月經(jīng)第2～5 天補(bǔ)佳樂 2～6mg/d，第 6～9 天 4～8mg/d，第10～13天6～10mg/d，B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜生長情況并據(jù)此適當(dāng)調(diào)整補(bǔ)佳樂劑量。也可在前一周期黃體中期給予GnRH-a，補(bǔ)佳樂也可采用恒量方案。當(dāng)內(nèi)膜≥7mm時(shí)，肌注黃體酮40～60mg/d或陰道用黃體酮轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，于使用黃體酮第4～5天進(jìn)行卵裂期胚胎移植；促排周期適用于月經(jīng)不規(guī)律或者前兩種方案無效者，應(yīng)用FSH/HMG，主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)14～15mm時(shí)開始每日或隔日行B超檢查并監(jiān)測(cè)LH峰，排卵后2～4d或LH峰（卵泡發(fā)育到18mm時(shí)，未測(cè)出LH峰，注射HCG 5 000～10 000IU）出現(xiàn)后4～5d進(jìn)行卵裂期胚胎移植。

1.3 妊娠結(jié)局 移植后第14天回生殖中心抽血檢查HCG，驗(yàn)血陽性者14d后再回中心行B超檢查確定是否臨床妊娠，并計(jì)算臨床妊娠率、胚胎種植率及多胎率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 共有562個(gè)移植周期，共解凍胚胎1 249枚，胚胎存活率95.32﹪。各組間患者內(nèi)膜準(zhǔn)備方案無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1；患者平均年齡、平均子宮內(nèi)膜厚度、平均移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2～4。

2.2 解凍后不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響 過夜培養(yǎng)后，A組478個(gè)周期，臨床妊娠率47.28﹪，種植率28.29﹪，多胎率26.99﹪；B組84個(gè)周期，臨床妊娠率51.19﹪，種植率30.68﹪，多胎率25.58﹪。兩組臨床妊娠率、種植率和多胎率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

2.3 胚胎過夜培養(yǎng)后增殖與否對(duì)妊娠結(jié)局的影響過夜培養(yǎng)后，A1組321個(gè)周期全部有增殖，臨床妊娠率 50.47﹪，種植率 30.92﹪，多胎率 28.40﹪；A2組131個(gè)周期部分增殖，臨床妊娠率38.93﹪，種植率 20.90﹪，多胎率 17.65﹪；A3組 26個(gè)周期均不增殖，臨床妊娠率50.0﹪，種植率34.55﹪，多胎率46.15﹪。A1組臨床妊娠率、種植率均高于A2組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），A1、A2組多胎率無明顯差異（P＞0.05）；A3組種植率、多胎率高于A2組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；A1組與A3組各指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表3。

2.4 過夜培養(yǎng)后是否存在融合胚胎對(duì)妊娠結(jié)局的影響 Aa組184個(gè)周期均有1個(gè)以上融合胚胎形成，Ab組則無融合胚胎形成。Aa組臨床妊娠率（59.78﹪）、種植率（37.95﹪）極顯著高于Ab組臨床妊娠率（38.43﹪）、種植率（21.12﹪），P=0.00，同時(shí)Aa組多胎率亦高于 Ab組（P＜0.05），見表4。

表1 患者內(nèi)膜準(zhǔn)備方案

表2 不同解凍時(shí)間妊娠結(jié)局比較

表3 過夜培養(yǎng)胚胎增殖與否對(duì)妊娠結(jié)局的影響比較

表4 有無融合胚胎對(duì)妊娠結(jié)局的影響

3 討論

隨著胚胎冷凍保存技術(shù)尤其是玻璃化冷凍技術(shù)的日益完善，解凍胚胎移植周期的臨床妊娠率逐漸提高，甚至超過新鮮周期移植的臨床妊娠率[6，7]，加上部分促排卵方案的應(yīng)用，如黃體期促排等及高齡患者累積胚胎的需要使得冷凍胚胎復(fù)蘇后移植在各中心所占比例有增高趨勢(shì)。

本研究比較了移植前一天下午解凍及移植當(dāng)天解凍胚胎的妊娠結(jié)局，結(jié)果兩者臨床妊娠率（47.28﹪ vs 51.19﹪），胚胎種植率（28.29﹪ vs 30.68﹪），多胎率（26.99﹪ vs 25.58﹪）均無明顯差異（P＞0.05）。這與相關(guān)研究[8～10]結(jié)果基本一致；而柴三明等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)天培養(yǎng)組臨床妊娠率和種植率均低于過夜培養(yǎng)組；Rato等[12]則得出相反結(jié)論；本研究中雖然當(dāng)天解凍組臨床妊娠率和種植率略有增高，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析主要原因可能為當(dāng)天解凍胚胎大部分為7～9細(xì)胞，Ⅰ～Ⅱ級(jí)優(yōu)質(zhì)胚胎，而提前解凍胚胎則優(yōu)胚和可用胚胎參差不齊，或者入選標(biāo)準(zhǔn)、冷凍方法及對(duì)移植時(shí)期選擇不同所致。

對(duì)于解凍后過夜培養(yǎng)妊娠結(jié)局，本研究顯示解凍后全部胚胎有增殖組其臨床妊娠率及種植率均明顯高于部分增殖組，而不增殖組臨床妊娠率、種植率及多胎率亦明顯高于部分增殖組且與全部增殖組各指標(biāo)無明顯差異，這與相關(guān)研究[9,13]不盡一致。全部胚胎增殖組能進(jìn)一步預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局方面一致，主要不同體現(xiàn)在無增殖組，Laverge等[14]通過對(duì)復(fù)蘇后無生長的胚胎進(jìn)行熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)這類胚胎僅有20﹪左右表現(xiàn)為正常的二倍體，其余表現(xiàn)為染色體異常，據(jù)此認(rèn)為復(fù)蘇后未進(jìn)一步生長的胚胎基本無利用價(jià)值，而本研究中復(fù)蘇后未增殖的胚胎在臨床妊娠率及種植率方面與此理論完全不符，其甚至高于部分增殖組，分析可能原因?yàn)槿虢M數(shù)據(jù)太少造成誤差，或者胚胎生長情況被觀察員忽略而誤判為未生長，當(dāng)然本研究若進(jìn)一步追蹤這部分患者的持續(xù)妊娠情況及活產(chǎn)分娩情況或許更能說明具體情況。但也從一個(gè)側(cè)面提示對(duì)過夜不增殖胚胎是否移植應(yīng)該持慎重態(tài)度，至少可以考慮進(jìn)一步培養(yǎng)囊胚以避免不必要的損失。

對(duì)于過夜后增殖中含有融合胚胎與否的妊娠結(jié)局研究提示含有融合胚胎組妊娠率、種植率及多胎率均顯著高于無融合胚胎組，與惠董娜等[15]的研究結(jié)果基本一致?？赡苓@類胚胎已經(jīng)打破了發(fā)育阻滯障礙，促進(jìn)了基因調(diào)控由母型調(diào)節(jié)向胚胎型調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化，對(duì)囊胚腔的形成、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及胚層分化發(fā)揮著積極作用，預(yù)示著更好的臨床結(jié)局[16，17]。但多胎率的增高是臨床工作者需高度重視的問題，對(duì)這部分患者或者應(yīng)該建議其行單胚胎移植。

綜上所述，胚胎解凍時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局影響不明顯，各中心可根據(jù)實(shí)際情況安排工作。解凍后過夜培養(yǎng)觀察胚胎進(jìn)一步發(fā)育情況，有全部增殖尤其含融合胚胎的周期預(yù)示著更好的妊娠結(jié)局，但同時(shí)應(yīng)警惕過高的多胎率，必要時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況行單胚胎移植。同時(shí)對(duì)于均無增殖的周期也應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度，可行直接移植或者繼續(xù)培養(yǎng)以避免不必要的損失。當(dāng)然，這一結(jié)論需要更多數(shù)據(jù)及更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)支持。

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