王若青 王 娜 王仁凱 陳松林

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

白化是由于黑色素代謝障礙導(dǎo)致眼睛、皮膚、毛發(fā)黑色素量減少或缺乏而引起的一種體色異?，F(xiàn)象。自然界中，哺乳類(柯永亮, 2006)、魚類(李仰真等,2014)、鳥類(梁偉等, 2000)、爬行類(張秋金等, 2009)等都存在白化個體。白化個體通常出現(xiàn)一系列病理學(xué)上的改變，且因自身缺乏保護(hù)色而易被捕食，因此，白化個體的生存能力大大低于正常個體。白化具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，是最早被研究的遺傳性疾病之一(Farabee, 1903)。哺乳動物如人和小鼠中白化研究最多，截止到 2011年，在小鼠中已發(fā)現(xiàn)的與體色、毛發(fā)相關(guān)的基因突變多達(dá) 378個(http://www.espcr.org/micemut/)。

自然界中生物體有多種多樣不同的體色，這是由于自身色素細(xì)胞能產(chǎn)生不同的色素。雖然哺乳動物中白化突變位點(diǎn)眾多，但色素細(xì)胞只有一種，即黑色素細(xì)胞。魚類中已發(fā)現(xiàn)的色素細(xì)胞共有6種：黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞、白色素細(xì)胞和藍(lán)色素細(xì)胞，暗示其可能的白化機(jī)制較哺乳動物更為復(fù)雜。白化在魚類中的研究主要集中于模式魚類斑馬魚(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)和穴居魚類(Kogaet al, 1997)，而養(yǎng)殖魚類中的研究較少。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一種冷溫性底棲肉食魚類，最適溫度為17℃～20℃，具有很高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值，深受消費(fèi)者的喜愛，市場十分廣闊，為我國重要的海水經(jīng)濟(jì)魚種。牙鲆育苗過程中經(jīng)常出現(xiàn)苗種高比例體色異?，F(xiàn)象，即有眼側(cè)皮膚白化和無眼側(cè)黑化現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了商品魚價值(朱學(xué)武等,2017)。目前，認(rèn)為牙鲆白化主要與營養(yǎng)(Seikaiet al, 1987;Yamamotoet al, 1992)、環(huán)境(Takahashi, 1994; Seikai,2010)和生理因素(Burtonet al, 1995; Seikai, 1992; Yooet al, 2000)等相關(guān)，而不管是營養(yǎng)還是生理方面，歸根到底都是由于分子水平的變化引起的。

MicroRNA(miRNA)多為 21～25 nt高度保守的單鏈非編碼小RNA，能夠通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)(UTR)互作而沉默靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。已發(fā)現(xiàn)有多個miRNA參與調(diào)控哺乳動物黑色素細(xì)胞發(fā)育及相關(guān)疾病(Kimet al, 2014;Zhuet al, 2010; Donget al, 2012)。牙鲆白化現(xiàn)象中是否涉及miRNA的表達(dá)及調(diào)控也值得深入研究。我們在前期研究中已經(jīng)利用高通量測序技術(shù)獲得了一批在牙鲆正常和白化皮膚中差異表達(dá)的基因和miRNA。本研究在此基礎(chǔ)上，選取tyrosinase related protein 1 (tyrp1)和mmu-miR-143-5p_R+2(mmu-143)開展了不同組織表達(dá)模式研究、靶基因預(yù)測及驗(yàn)證分析等，將為牙鲆白化發(fā)生分子機(jī)制的闡明提供重要的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)用魚為發(fā)育狀況良好且無傷病的有眼側(cè)皮膚全為黑色的正常牙鲆和發(fā)育狀況良好且無傷病的有眼側(cè)皮膚白化牙鲆，由山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司提供。分別取5月齡正常和白化牙鲆的有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)皮膚、有眼側(cè)肌肉、無眼側(cè)肌肉、性腺、鰓、腦、腸、眼、心臟、腎臟、脾臟、肝臟13個組織樣品，立即放入液氮中保存，以備后續(xù)提取 RNA使用。293T細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2 牙鲆各組織Total RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

采用TIANGEN miRcute miRNA提取分離試劑盒提取牙鲆各組織的 Total RNA，然后用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質(zhì)量，用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。RNA樣品于–80℃保存。

各取1 μg的Total RNA用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，–20℃保存，用于克隆基因中間片段。用SMARTer?RACE 5′/3′Kit (Clontech)合成 5′和 3′ Ready，用于 5′和3′RACE的克隆。

1.3 tyrp1基因的克隆

利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果鑒定出tyrp1的2個轉(zhuǎn)錄本：tyrp1GS_012029(tyrp1-29)和tyrp1GS_009038(tyrp1-38)，此處以tyrp1-29為例進(jìn)行基因克隆介紹。以正常牙鲆有眼側(cè)皮膚cDNA為模板，以tyrp1-29-F1和 tyrp1-29-R1(表1)為引物進(jìn)行中間片段的 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體積為50 μl，反應(yīng)程序：94℃，5 min；94℃30 s，54℃ 30 s，72℃ 50 s (35 個循環(huán))；72℃，10 min。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)，挑取 3～5個陽性克隆送到瑞博興科公司測序。利用Vector NTI Advance 11軟件進(jìn)行測序結(jié)果的對比分析。

利用驗(yàn)證的中間片段設(shè)計引物tyrp1-29-5′GSP、tyrp1-29-5′NGSP、tyrp1-29-3′GSP 和 tyrp1-29-3′NGSP(表1)，以合成的 Ready為模板進(jìn)行tyrp1-295′和3′RACE的巢式PCR擴(kuò)增。一輪反應(yīng)結(jié)束后，將一輪PCR產(chǎn)物稀釋 50倍作為二輪 PCR的模板進(jìn)行二輪PCR，將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)，挑取3～5個陽性克隆送到瑞博興科公司測序。利用Vector NTI Advance 11軟件進(jìn)行測序結(jié)果的對比分析。

1.4 tyrp1基因序列拼接及蛋白分析

在成功得到tyrp1-29和tyrp1-38基因的中間片段、5′端及 3′端后，用 Vector NTI Advance 11進(jìn)行序列拼接，獲得完整的tyrp1-29和tyrp1-38序列，然后進(jìn)行開放閱讀框分析和蛋白質(zhì)翻譯。從NCBI中下載其他不同物種的Tyrp1的氨基酸序列，與得到的牙鲆Tyrp1氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，用MEGA 5.0軟件中 NJ法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置1000次bootstraps進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化評估。

1.5 tyrp1基因?qū)崟r熒光定量PCR

用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR，用 Primer 6.0設(shè)計定量引物tyrp1a-qF和tyrp1a-qR(表1)進(jìn)行tyrp1a基因的熒光定量檢測。以β-actin為內(nèi)參，以正常和白化牙鲆的13個組織的cDNA為模板，各組織均選取3個平行的實(shí)驗(yàn)個體，每個實(shí)驗(yàn)個體3次重復(fù)。ABI 7500 Realtime PCR儀(Applied Biosystems, 美國)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s (40 循環(huán))；95℃ 15 s；60℃1 min；95℃ 15 s。

1.6 tyrp1a與miRNA的互作關(guān)系預(yù)測

利用RNAhybrid (https://bibiserv.cebitec.uni- Bielefeld.de/rnahybrid?id=rnahybrid_view_submission)將已克隆得到的tyrp1a基因3′UTR序列與miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，預(yù)測到tyrp1a與mmu-143可能的靶向關(guān)系。

1.7 miRNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量

由于TIANGEN miRcute miRNA提取分離試劑盒提取的牙鲆各組織的Total RNA中包含miRNA等small RNA，因此，可直接用 TIANGEN miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

得到miRNA的cDNA后，用TM Utility 1.5-iTech設(shè)計mmu-143上游定量引物mmu-143-F(下游由定量試劑盒中提供)進(jìn)行熒光定量檢測。以5S rRNA(表1)為內(nèi)參，以正常和白化牙鲆的 13個組織的 miRNA cDNA為模板，各組織均選取3個平行的實(shí)驗(yàn)個體，每個實(shí)驗(yàn)個體重復(fù)3次。用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green, TIANGEN)進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系：10 μl 2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)，mmu-143-F(10 μmol/L)和Reverse Primer (10 μmol/L)各 0.4 μl，2 μl 50×ROX Reference Dye，1.5 μl miRNA 第一鏈 cDNA，5.7 μl ddH2O，總體積 20 μl。反應(yīng)程序：95℃ 15 min；94℃20 s，60℃ 34 s(40循環(huán))；熔解曲線分析。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.8 雙熒光素酶載體 pmiR-RB-REPORT?的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

為了證明tyrp1a3'UTR與miRNA mmu-143存在靶對應(yīng)關(guān)系，采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)在293T細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，所用的雙熒光素酶報告載體 pmiR-RBREPORT?及mmu-143 mimic和mimic Ncontrol均為廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計提供。

用Primer 6.0設(shè)計分別帶有XhoI和NotI酶切位點(diǎn)的上下游引物 tyrp1a-3′ UTR_F和 tyrp1a-3′ UTR_R(表1)，以正常牙鲆皮膚的 cDNA為模板，PCR擴(kuò)增tyrp1a3′ UTR區(qū)片段并插入到pmiR-RB-REPORT?載體的hRluc下游，構(gòu)建成載有靶片段的完整載體，與mmu-143 mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中(表2，A組)。另外，將pmiR-RB-REPORT?上的靶片段用TaKaRa MutanBEST Kit進(jìn)行突變后與 mmu-143共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，作為一組對照實(shí)驗(yàn)(表2，B組)。正常和突變的載體分別與miRNA的陰性對照NC共轉(zhuǎn)染作為2組對照(表2，C組和D組)。

表2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系成分Tab.2 The composition of cell transfection

1.9 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的 293T細(xì)胞以每孔大約 5×104細(xì)胞接種于24孔板中，于37℃、5%的CO2的條件下培養(yǎng)過夜后，采用lipofectamine 2000按照表2的體系進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)48 h后，用碧云天公司提供的雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒來檢測并分析miRNA與靶片段是否有互作關(guān)系。

1.10 數(shù)據(jù)計算方法

定量PCR實(shí)驗(yàn)中基因或miRNA的相對表達(dá)水平采用 2(?ΔΔCt)方法計算，其數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)。用 SPSS 17.0分析軟件采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，并進(jìn)行 Duncan多重比較，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異顯著，當(dāng)P＜0.01認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆tyrp1基因全長及其蛋白分析

通過RACE方法成功克隆了tyrp1-29和tyrp1-28，tyrp1-29基因cDNA全長為2145 bp，開放閱讀框(ORF)為 1566 bp，5′ UTR 區(qū)為 127 bp，3′ UTR 區(qū)為 452 bp(圖1)。用Vector NTI Advance 11軟件查找ORF區(qū)并翻譯成蛋白質(zhì)，基因編碼區(qū)編碼521個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為58.34 kDa。分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，第 1～17個氨基酸為信號肽，第 84～112個氨基酸為EGF區(qū)，第 172～407個氨基酸為 PFAM 結(jié)構(gòu)域，469～491個氨基酸為跨膜區(qū)。

tyrp1-38基因cDNA全長1792 bp，開放閱讀框(ORF)為 1602 bp，5′ UTR 區(qū)為 49 bp，3′ UTR 區(qū)為141 bp(圖2)。用Vector NTI Advance 11軟件查找ORF區(qū)并翻譯成蛋白質(zhì)，基因編碼區(qū)編碼533個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為61.10 kDa。分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，第27～70個氨基酸為NH區(qū)，第137～190個氨基酸為GLA區(qū)，第475～497個氨基酸為跨膜區(qū)。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將在NCBI和Ensemble查找到的11種Tyrp1蛋白序列：刺魚(Gasterosteus aculeatus) Tyrp1a (ENSGACG00000019503)、青鳉 Tyrp1a (ENSORLG00000-004326)、河豚(Fugu rubripes) Tyrp1a (ENSTRUG-00000012615)、斑馬魚Tyrp1a (ENSDARG00000029-204)、刺魚 Tyrp1b (ENSGACG00000015912)、青鳉Tyrp1b (ENSORLG00000004723)、斑馬魚 Tyrp1b(NP_001002749.1)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)Tyrp1 (NP_001016476.1)、雞(Gallus gallus) Tyrp1(NP_990376.2)、小鼠(Mus musculus)Tyrp1 (NP_112479.1)及人 (Homo sapiens) Tyrp1 (NP_000541.1)與牙鲆的Tyrp1-29和Tyrp1-38一起利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，序列號為 NP開頭的來自于NCBI，以ENS開頭的來自于在線軟件Ensembl。結(jié)果顯示，熱帶爪蟾、雞、小鼠及人的tyrp1只有一個轉(zhuǎn)錄本，牙鲆tyrp1-29基因與硬骨魚類中刺魚、青鳉、河豚和斑馬魚的tyrp1a親緣關(guān)系較近，而牙鲆tyrp1-38基因與刺魚、青鳉和斑馬魚的tyrp1b親緣關(guān)系較近。由此將牙鲆tyrp1-29和tyrp1-38分別鑒定為tyrp1a和tyrp1b基因，NCBI GenBank登錄號分別為MF095844和MF095845。

圖1 牙鲆tyrp1-29基因序列及其開放閱讀框(ORF)預(yù)測的氨基酸序列Fig.1 ORF sequence and deduced amino acid sequence of tyrp1-29 in Japanese flounder

2.3 tyrp1a熒光定量結(jié)果

由圖4可以看出，tyrp1a的表達(dá)量在正常牙鲆的眼中表達(dá)量最高，皮膚次之，第三是性腺，在肝臟、腦和脾中也均有表達(dá)，在腹部皮膚、背部肌肉、腹部肌肉、鰓、腸、腎和心臟中幾乎不表達(dá)；tyrp1a的表達(dá)量在白化牙鲆的眼中表達(dá)量最高，性腺次之，第三是腹部肌肉，在皮膚、鰓和腦中也均有表達(dá)，在腹部皮膚、背部肌肉、肝臟、腸、脾、腎和心臟中幾乎不表達(dá)。

2.4 靶基因預(yù)測

用Bielefeld BioInformatics Service RNAhybrid軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測后，得出tyrp1a3′UTR區(qū)的第119～126 bp處與mmu-143可能存在靶對應(yīng)關(guān)系(圖5)。

2.5 mmu-143熒光定量結(jié)果

由圖6可以看出，miRNA mmu-143在正常牙鲆的性腺中表達(dá)量最高，鰓次之，第三是腸，除了在肝臟中幾乎不表達(dá)外，其他各組均有表達(dá)；mmu-143在白化牙鲆的腹部肌肉中表達(dá)量最高，腸次之，第三是性腺，在皮膚、腹部皮膚、鰓、腦、背部肌肉、肝臟、腸、脾、腎和心臟中均有表達(dá)。將 mmu-143的定量結(jié)果與tyrp1a的定量結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，tyrp1a在正常皮膚中的表達(dá)量明顯高于白化皮膚，而 mmu-143在白化皮膚中的表達(dá)量約為正常皮膚中的2倍，這一結(jié)果與之前的高通量測序結(jié)果一致。

圖2 牙鲆tyrp1-38基因序列及其開放閱讀框(ORF)預(yù)測的氨基酸序列Fig.2 ORF sequence and deduced amino acid sequence of tyrp1-38 in Japanese flounder

圖3 以NJ法建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree based on NJ method

圖4 tyrp1a基因在正常和白化牙鲆不同組織中的表達(dá)Fig.4 Expression of tyrp1a in various tissues of control and albinism of P. olivaceus

2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

MiRNA mmu-143與其預(yù)測靶基因tyrp1a的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。一般情況下，mmu-143 mimics跟陰性對照相比，報告熒光值下調(diào) 30%及以上，則認(rèn)為mmu-143 mimics對tyrp1a基因有調(diào)控作用。分析該實(shí)驗(yàn)雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，mmu-143 mimic將 tyrp1a-WT的報告熒光下調(diào)38.2%，對其預(yù)測靶位點(diǎn)進(jìn)行突變后，tyrp1a-MU的報告熒光下調(diào)15.2%。該結(jié)果表明，tyrp1a很可能是mmu-143的靶基因，mmu-143通過調(diào)控tyrp1a基因的表達(dá)來影響牙鲆的白化情況。

3 討論

黑色素主要起到吸收光照和色素沉積的作用，而牙鲆皮膚白化主要是因?yàn)槿狈谏亍：谏厥怯衫野彼崦讣跋嚓P(guān)酶發(fā)揮作用合成的，在脊椎動物中，酪氨酸酶基因家族主要由三位成員組成：tyrosinase(tyr)、tyrp1和tyrp2(Nowaket al, 1997)。Tyrp1 被稱為酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1，定位于小鼠brown位點(diǎn)，該基因在真黑素形成中發(fā)揮的關(guān)鍵作用已引起研究者們的高度重視(Ito, 2003; Jiménez-Cervanteset al,1994)。研究發(fā)現(xiàn)，Tyrp1是一種由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的跨膜蛋白，通過高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)到黑色素體內(nèi)(Ghanemet al,2011)，其編碼蛋白與酪氨酸酶(TYR)編碼蛋白同源性高達(dá)40%(Jacksonet al, 1992)，與酪氨酸相關(guān)蛋白2(Tyrp2)共同構(gòu)成酪氨酸家族來調(diào)控體內(nèi)黑色素合成，并且對黑色素細(xì)胞的發(fā)育、生存和功能起重要調(diào)節(jié)作用(Jiménez-Cervanteset al, 1994; Delet al, 1993;Hearing, 1999)。有實(shí)驗(yàn)證明，tyrp1突變或缺失會導(dǎo)致狗(Schmutzet al, 2002)、貓(Schmidt-Küntzelet al,2005)、牛(Berryereet al, 2003)、羊(Grattenet al, 2007)和日本鵪鶉(Nadeauet al, 2007)的毛色變成灰色。已有報道顯示，硬骨魚類中大多存在2種tyrp1的同源基因，即tyrp1a和tyrp1b(Braaschet al, 2007、2009)。本研究在牙鲆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)了tyrp1的2個轉(zhuǎn)錄本，分析進(jìn)一步證實(shí)這 2個轉(zhuǎn)錄本tyrp1-29和tyrp1-38分別為tyrp1a和tyrp1b基因。

圖5 mmu-143的靶基因預(yù)測Fig.5 Target prediction of mmu-143

圖6 mmu-143在正常和白化牙鲆不同組織中的表達(dá)Fig.6 Expressions of mmu-143 in various tissues of control and albinism of P. olivaceus

圖7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 The results of dual luciferase experiment

Tyrp1a基因在正常和白化牙鲆的有眼側(cè)皮膚、無眼側(cè)皮膚、有眼側(cè)肌肉、無眼側(cè)肌肉、性腺、鰓、腦、腸、眼、心臟、腎臟、脾臟、肝臟這13個組織中的表達(dá)情況差異明顯。正常和白化牙鲆各組織中tyrp1a表達(dá)量最高的是眼組織，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各組織的表達(dá)量，這一結(jié)果與彩鯉中的表達(dá)情況一致(李康樂,2014)，猜測tyrp1a可能參與牙鲆變態(tài)過程中眼睛的偏轉(zhuǎn)及骨骼的重塑。定量結(jié)果顯示，正常牙鲆皮膚中tyrp1a基因的表達(dá)量應(yīng)遠(yuǎn)高于白化皮膚中的表達(dá)量，這與tyrp1a基因能促進(jìn)黑色素細(xì)胞中黑素體的形成相關(guān)(崔嘉等, 2009)，且與高通量測序結(jié)果一致。其次，tyrp1a基因在正常和白化牙鲆的性腺和腦中均有表達(dá)，在腹部皮膚、背部肌肉、腸、腎和心臟中幾乎不表達(dá)。

在哺乳動物和鳥類中已有實(shí)驗(yàn)證明，miRNA能通過調(diào)控靶基因來控制黑色素的形成，如miR508-3p(Zhanget al, 2017)、miR-21a-5p (Wanget al, 2016)、lpa-miR-nov-66 (Yanget al, 2015)、miR-204 (Apopoet al, 2015)等。MicroRNA-203能通過與驅(qū)動蛋白5b相互作用，從而調(diào)控黑色素細(xì)胞中黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)和酪氨酸酶表達(dá)(Noguchiet al, 2014; Zhanget al, 2014)。因此，通過對牙鲆miRNA的表達(dá)分析，可以幫助我們?nèi)ヌ接憁iRNA在基因表達(dá)調(diào)控中的功能，更好地解釋miRNA在牙鲆白化中的分子調(diào)控機(jī)制。

通過tyrp1a基因與mmu-143的定量結(jié)果可以看出，二者在正常和白化牙鲆皮膚、肌肉、性腺、肝、腦和腸中的表達(dá)呈一定的反比例關(guān)系，例如tyrp1a在正常牙鲆皮膚中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于白化皮膚，而mmu-143在白化牙鲆皮膚中的表達(dá)量約為正常皮膚中的2.1倍。RNAhybrid軟件預(yù)測結(jié)果顯示，可基本確定二者存在靶基因關(guān)系，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這種負(fù)調(diào)控關(guān)系，說明 mmu-143是通過調(diào)控tyrp1a基因的表達(dá)來影響牙鲆白化發(fā)生的。

本研究成功鑒定出牙鲆存在 2種tyrp1基因，tyrp1a和tyrp1b基因，定量結(jié)果顯示，tyrp1a在正常牙鲆皮膚中的表達(dá)量顯著高于白化皮膚中的表達(dá)量，與mmu-143在正常和白化皮膚中的表達(dá)量剛好相反，均與高通量測序結(jié)果一致。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明tyrp1a與 mmu-143存在靶基因互作關(guān)系。這一結(jié)果豐富了對牙鲆白化分子機(jī)制的認(rèn)識。

Apopo S, Liu H, Jing L,et al. Identification and profiling of microRNAs associated with white and black plumage pigmentation in the white and black feather bulbs of ducks by RNA sequencing. Animal Genetics, 2015, 46(6): 627–635

Berryere TG, Schmutz SM, Schimpf RJ,et al. TYRP1 is associated with dun coat colour in Dexter cattle or how now brown cow? Animal Genetics, 2003, 34(3): 169–175

Braasch I, Liedtke D, Volff JN,et al. Pigmentary function and evolution of tyrp1 gene duplicates in fish. Pigment Cell &Melanoma Research, 2009, 22(6): 839–850

Braasch I, Liedtke D, Volff JN,et al. Pigmentary function and evolution of tyrp1 gene duplicates in fish. Pigment Cell &Melanoma Research, 2009, 22(6): 839–850

Braasch I, Schartl M, Volff JN. Evolution of pigment synthesis pathways by gene and genome duplication in fish. BMC Evolutionary Biology, 2007, 7: 74

Burton D, Vokey J, Mayo D. Adrenoceptors in cryptic patterning of a flatfish,Pleuronectes americanus. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences, 1995, 261(1361): 181–186

Cui J, Sun SR, Miao LX,et al. The research progress of TYRP1 regulate animal pigment formation. Chinese Veterinary Surgeon, 2009, 36(9): 94–96 [崔嘉, 孫守榮, 苗魯旭, 等.TYRP1基因控制動物色素形成的研究進(jìn)展. 中國畜牧獸醫(yī), 2009, 36(9): 94–96]

Del MV, Ito S, Jackson I,et al. TRP-1 expression correlates with eumelanogenesis in human pigment cells in culture. FEBS Letters, 1993, 327(3): 307–310

Dong C, Wang H, Xue L,et al. Coat color determination by miR-137 mediated down-regulation of microphthalmiaassociated transcription factor in a mouse model. RNA,2012, 18(9): 1679–1686

Farabee WC. Notes on negro albinism. Science, 1903, 17(419): 75

Ghanem G, Fabrice J. Tyrosinase related protein 1 (TYRP1/gp75)in human cutaneous melanoma. Molecular Oncology, 2011,5(2): 150–155

Gratten J, Slate J. Compelling evidence that a single nucleotide substitution in TYRP1 is responsible for coat-colour polymorphism in a free-living population of Soay sheep.Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences,2007, 274(1610): 619–626

Hearing VJ. Biochemical control of melanogenesis and melanosomal organization. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings, 1999, 4(1): 24–28

Ito S. The IFPCS presidential lecture: a chemist's view of melanogenesis. Pigment Cell Research, 2003, 16(3): 230–236

Jackson IJ, Chambers DM, Tsukamoto K,et al. A second tyrosinase-related protein, TRP-2, maps to and is mutated at the mouse slaty locus. Embo Journal, 1992, 11(2): 527–535

Jiménez-Cervantes C, Solano F, Kobayashi T,et al. A new enzymatic function in the melanogenic pathway. The 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase activity of tyrosinase-related protein-1 (TRP1). Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(27): 17993–18000

Ke YL. Albino disease in humans and animals. Science and Culture, 2006, 11 [柯永亮. 人與動物中的白化病. 科學(xué)與文化, 2006, 11]

Kim KH, Bin BH, Kim J,et al. Novel inhibitory function of miR-125b in melanogenesis. Pigment Cell & Melanoma Research, 2014, 27(1): 140–144

Koga A, Hori H. Albinism due to transposable element insertion in fish. Pigment Cell Research, 1997, 10(6): 377–381

Li KL. Molecular cloning and expression analysis of pigmentationrelated genes, Sox10, Agouti, Tyrp1 and Dct, in Oujiang color commom carp,Cyprinus carpio var. Color. Master′s Thesis of Shanghai Ocean University, 2014 [李康樂. 甌江彩鯉體色相關(guān)基因Sox10、Agouti、Tyrp1、Dct的分子克隆與表達(dá)分析. 上海海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2014]

Li YZ, Chen SL, Xing HF,et al. Preliminary study on the albinism of half-smooth tougue sole (Cynoglossus semilaevis). Journal of Fisheries of China, 2014, 38(1):76–83 [李仰真, 陳松林, 邢賀飛, 等. 半滑舌鰨白化現(xiàn)象的初步研究. 水產(chǎn)學(xué)報, 2014, 38(1): 76–83]

Liang W, Guo DS, Song J,et al. An example of a white silver larynx was found in the Xiaolongmen forest of Beijing.Chinese Journal of Zoology, 2000, 35(1): 59 [梁偉, 郭冬生,宋杰, 等. 北京小龍門林場發(fā)現(xiàn)一例白化銀喉長尾山雀.動物學(xué)雜志, 2000, 35(1): 59]

Nadeau NJ, Mundy NI, Gourichon D,et al. Association of a single-nucleotide substitution in TYRP1 with roux in Japanese quail (Coturnix japonica). Animal Genetics, 2007,38(6): 609–613

Noguchi S, Kumazaki M, Yasui Y,et al. MicroRNA-203 regulates melanosome transport and tyrosinase expression in melanoma cells by targeting kinesin superfamily protein 5b. Journal of Investigative Dermatology, 2014, 134(2): 461–469

Nowak MA, Boerlijst MC, Cooke J,et al. Evolution of genetic redundancy. Nature, 1997, 388(6638): 167–171

Schmidt-Küntzel A, Eizirik E, O'Brien SJ,et al. Tyrosinase and tyrosinase related protein 1 alleles specify domestic cat coat color phenotypes of the albino and brown loci. Journal of Heredity, 2005, 96(4): 289–301

Schmutz SM, Berryere TG, Goldfinch AD. TYRP1 and MC1R genotypes and their effects on coat color in dogs. Mammalian Genome, 2002, 13(7): 380–387

Seikai T, Watanabe T, Shimozaki M. Influence of three geographically different strains ofArtemianauplii on occurrence of albinism in hatchery-reared flounderParalichthys olivaceus. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1987, 53(2):195–200

Seikai T. Influences of fluorescent light irradiation, ocular side pigmentation, and source of fishes on the blind side pigmentation in the young Japanese flounder,Paralichthys olivaceus. Suisanzoshoku, 2010, 39(1): 21–60

Seikai T. Process of pigment cell differentiation in skin on the left and right sides of the Japanese flounder,Paralichthys olivaceus, during metamorphosis. Ichthyological Research,1992, 39(1): 85–92

Takahashi YI. Influence of stocking density and food at late phase of larval period on hypermelanosis on the blind body side in juvenile Japanese flounder. Nihon-suisan-gakkai-shi,1994, 60(5): 593–598

Wang P, Zhao Y, Fan R,et al. MicroRNA-21a-5p functions on the regulation of melanogenesis by targeting Sox5 in mouse skin melanocytes. International Journal of Molecular Sciences,2016, 17(7): 959

Yamamoto T, Fukusho K, Okauchi M,et al. Effect of various foods during metamorphosis on albinism in juvenile of flounder. Nihon-suisan-gakkai-shi, 1992, 58(3): 499–508

Yang S, Fan R, Shi Z,et al. Identification of a novel microRNA important for melanogenesis in alpaca (Vicugna pacos).Journal of Animal Science, 2015, 93(4): 1622–1631

Yoo JH, Takeuchi T, Tagawa M,et al. Effect of thyroid hormones on the stage-specific pigmentation of the Japanese flounderParalichthys olivaceus. Zoological Science, 2000, 17(8):1101–1106

Zhang B, Zhang J, Sun L. In-depth profiling and analysis of host and viral microRNAs in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) infected with megalocytivirus reveal involvement of microRNAs in host-virus interaction in teleost fish. BMC Genomics, 2014, 15(1): 1–15

Zhang J, Liu Y, Zhu Z,et al. Role of microRNA508-3p in melanogenesis by targeting microphthalmia transcription factor in melanocytes of alpaca. Animal, 2017, 11(2): 236–243

Zhang QJ, Chen YL, Xie SH. An example of an albino Wang Jin snake was found in the Shaowu of Fujian. Chinese Journal of Zoology, 2009, 44(2): 47 [張秋金, 陳友鈴, 謝少和. 福建邵武發(fā)現(xiàn)一例白化王錦蛇. 動物學(xué)雜志, 2009, 44(2):47]

Zhu XW, Xu YJ, Liu XZ,et al. Physiological mechanisms for degeneration of blind-side hypermelanosis in pond-cultured Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(1): 103–110 [朱學(xué)武, 徐永江,柳學(xué)周, 等. 池塘養(yǎng)殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)無眼側(cè)體色黑化消褪機(jī)理. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2017, 38(1):103–110]

Zhu Z, He J, Jia X,et al. MicroRNA-25 functions in regulation of pigmentation by targeting the transcription factor MITF in Alpaca (Lama pacos) skin melanocytes. Domestic Animal Endocrinology, 2010, 38(3): 200–209