康傳磊 李秋芬 張 艷 陳世波 王 越

(1. 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；3. 青島市卓越海洋集團有限公司 青島 266408)

近年來，水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展實現了由粗放式到集約化的轉變，高密度養(yǎng)殖模式帶來高產量、高收益，但同時存在水體殘餌、糞便等有機物積累較快的問題。養(yǎng)殖水體氮濃度的快速上升，導致水體自凈能力嚴重下降(劉道玉等, 2011)。由于氨氮和亞硝酸氮等物質對水生動物的毒性較大，嚴重影響了水產動物的健康和生長，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。同時，未經處理的含高氮、高有機物的養(yǎng)殖廢水排入沿海水域，也會加劇近海的富營養(yǎng)化，反過來影響?zhàn)B殖水質。因此，降低養(yǎng)殖系統(tǒng)中氮濃度是提高養(yǎng)殖水質的關鍵。

生物脫氮技術被認為是去除養(yǎng)殖污水氮元素最為有效且經濟的方式，且無二次污染(Padhiet al, 2013;姜磊等, 2013; Layva-Diazet al, 2015)。Kozasa(1986)首次將微生物制劑應用于水產養(yǎng)殖業(yè)，此后，越來越多的硝化細菌從不同環(huán)境中分離篩選出來，并用于后續(xù)脫氮特性研究(汪曉晨等, 2014; 陸洪省等, 2014)，但傳統(tǒng)自養(yǎng)硝化細菌去除水體氨氮和亞硝酸氮之后，存在硝酸氮積累的問題，同時硝化細菌生長緩慢、培養(yǎng)困難且價格高(羅小溪等, 2013)。

水產養(yǎng)殖的特殊模式決定了脫氮過程中的硝化作用和反硝化作用只存在于好氧情況下(張小玲等,2011)。但傳統(tǒng)理論認為，自養(yǎng)硝化作用與厭氧反硝化作用是兩個獨立的部分，因此，硝化作用與反硝化作用不能在同一條件下進行(潘玉瑾等, 2016)。Robertson等(1984)在除硫和反硝化處理系統(tǒng)中首次分離出好氧反硝化菌泛養(yǎng)副球菌(Paracoccus pantotropha)，異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌的出現表明在好氧情況下可實現同時硝化反硝化(SND)。目前，篩選到的異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌種類越來越多，已報道的脫氮細菌有假單胞菌屬(Pseudomonas) (Myaharaet al, 2012)、鹽單胞菌屬(Halomonas alkaliphila) (孫雪梅等, 2012)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(何偉等, 2009)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(辛玉峰等, 2011)和產堿菌屬(Alcaligenes)(余潤蘭等, 2012)等。目前，大多數研究集中在異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌的分離篩選以及脫氮特性(Renet al, 2014; 梁賢等, 2015; 孫慶花等,2016; 石小彤等, 2013; 成鈺等, 2016)，將異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌應用于實際海水養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的報道尚少。本研究將實驗室篩選的 3株高效異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌進行不同組合后應用到圓斑星鰈(Verasper variegates)養(yǎng)殖過程中，以探究其在實際生產中的脫氮效果，并為其應用技術的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

3株異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌均由本實驗室篩選、保存，具有異養(yǎng)硝化–好氧反硝化功能。嗜堿鹽單胞菌(Halomonas alkaliphila) X3篩選自浙江象山港網箱魚類養(yǎng)殖區(qū)富營養(yǎng)沉積環(huán)境，在氨氮含量為42 mg/L的測試液中，24 h時，對氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的去除率分別為98.29%、99.07%和96.48%(孫雪梅等, 2012)。花津灘芽孢桿菌(Bacillus hwajinpoensis)SLWX2篩選自青島市紅島刺參養(yǎng)殖池塘的水體環(huán)境，24 h對氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的去除率分別達到100%、99.5%和85.6%，在1%～8% NaCl條件下均能生長(成鈺等, 2016)。

麥氏交替單胞菌(Alteromonas macleodii) SLNX2篩選自青島市紅島刺參養(yǎng)殖池塘的沉積環(huán)境，24 h對氨氮、亞硝酸氮的去除率分別達到100%、36.1%，72 h對硝酸氮的去除率達到 82.2%(擬另文發(fā)表)。下文以W代表SLWX2，X代表X3，N代表SLNX2。

圓斑星鰈由青島卓越海洋集團有限公司提供，規(guī)格為(98±6)g。

實驗所用飼料：碟類慢沉顆粒配合飼料，由常熟泉興營養(yǎng)添加劑有限公司生產提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計與日常管理 實驗在青島卓越海洋集團有限公司養(yǎng)殖車間進行，選取規(guī)格一致的圓斑星鰈，在養(yǎng)殖池中暫養(yǎng) 10 d后，從中挑選健康、有活力的240尾進行實驗，每個規(guī)格為50 L的塑料整理箱中加入30 L消毒海水和10尾已消毒圓斑星鰈；設置8個處理組，以不添加脫氮細菌的為對照組，細菌投放組合類型如表1所示，每個處理組3個平行。實驗期間，第5、11、17天各投菌1次，菌液終濃度控制在1.3×106CFU/ml。實驗共進行21 d。

實驗期間，各池保持不換水，定時補充新鮮淡水，維持水體體積不變。使用充氣泵充氧，使溶氧維持在7～9 mg/L。每日09:00投喂飼料。

1.2.2 水樣采集與檢測 每2天09:00投餌前，使用YSI-556多功能水質分析儀測定水質pH、溶解氧、溫度和鹽度。將箱內水混合均勻后，在中央距離水面10 cm處采集水樣。使用離心機將水樣6000 r/min離心 5 min，取上清液。參照中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局等《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB 17378.4-2007)，氨氮的測定采用次溴酸鹽氧化法，亞硝酸氮的測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法，硝酸氮的測定采用鋅–鎘還原法，化學需氧量(COD)的測定采用堿性高錳酸鉀法，總氮測定使用總有機碳(Total organic carbon, TOC)分析儀(TOC-VCPH, TNM-1)。

1.3 數據處理

利用Excel軟件進行數據處理，實驗數據用平均數±標準差(Mean±SD)表示；采用 SPSS 19統(tǒng)計軟件對數據作統(tǒng)計分析，顯著水平P采用0.05，極顯著水平P采用0.01。

表1 實驗設計Tab.1 The experimental design

2 結果與分析

2.1 各組pH、溶氧、溫度和鹽度的變化

實驗期間，pH、溶氧(DO)、溫度(T)和鹽度(S)指標各組之間無顯著差異(P>0.05)。pH 為 7.69±0.23、DO 為(8.325±0.385) mg/L、T為(21.95±0.55)℃、S為29.7±0.6。各組各項指標值均處于正常范圍內，滿足圓斑星鰈養(yǎng)殖條件。具體指標測定數值見表2。

表2 指標測定值Tab.2 The determined value of each parameter

2.2 不同組合的氨氮去除效果

隨著養(yǎng)殖時間的推移，各組氨氮濃度呈逐漸升高的趨勢。如圖1所示，第5天第1次加菌后，各加菌組氨氮濃度上升幅度均低于對照組，并于第7～9天，各實驗組氨氮濃度與對照組出現極顯著性差異(P<0.01)，說明第5天投加不同組合菌液之后，氨氮去除效果顯著。從第11天開始，實驗組中單菌組對氨氮的去除效果開始下降，但復合組的去除能力持續(xù)有效，其中，W+X+N組合優(yōu)勢最為明顯，與其他各實驗組存在極顯著性差異(P<0.01)，尤其在第17天第3次加菌后，氨氮濃度明顯下降。到第 21天時，W+X+N組、W+X組、W+N組、X+N組、X組、W組及 N組氨氮濃度比對照組分別降低 68.55%(P<0.01)、54.38%(P<0.01)、52.61%(P<0.01)、44.93%(P<0.01)、40.74%(P<0.01)、33.48%(P<0.01)和 26.16%(P<0.01)，說明異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌對氨氮有很好的去除效果，其中，W+X+N組去除效果最明顯，能將氨氮濃度維持在較低水平。

圖1 各組氨氮濃度的變化Fig.1 The variation of ammonia-nitrogen concentration in different groups

2.3 不同組合的亞硝酸氮去除效果

實驗期間，各加菌組與對照組亞硝酸氮濃度9 d前均處于較低濃度，第11天開始逐漸積累增加。如圖2所示，第5天第1次加菌后，加菌組的亞硝酸氮濃度始終低于對照組，第7～15天，除單菌組(W組、X組和N組)之外，復合菌組均與對照組存在顯著性差異(P<0.05)。從第17天第3次加菌后開始，各加菌組均與對照組產生顯著性差異(P<0.05)，可能是3株細菌已經逐步適應養(yǎng)殖環(huán)境。到第19天時，W+X+N組、W+X組、W+N組、X+N組、X組、W組及N組亞硝酸氮濃度與對照組差異達到最大值，分別比對照組降低 48.36%(P<0.01)、41.25%(P<0.01)、35.56%(P<0.01)、25.42%(P<0.01)、26.38%(P<0.01)、29%(P<0.01)和 17.99%(P<0.01)，說明復合細菌在去除氨氮的同時，對亞硝酸氮也有良好的去除效果。

圖2 各組亞硝酸氮濃度的變化Fig.2 The variation of nitrite-nitrogen concentration in different groups

2.4 不同組合的硝酸氮去除效果

整個養(yǎng)殖期間，各組硝酸氮濃度的變化呈現大致先升高后下降再升高的規(guī)律(圖3)。第5天第1次加菌后，第7天開始，除 N組外，各加菌組硝酸氮濃度均低于對照組，說明投加的菌液起到反硝化的作用。其中，W+X+N組反硝化作用最好，第 1～13天將水體硝酸氮濃度維持在較低水平，并于第13天達到最低濃度0.51 mg/L。到第21天時，對照組的硝酸氮已達到7.05 mg/L，各加菌組均與對照組存在顯著差異(P<0.05)(除 N組外)，但各加菌組間差異不顯著(P>0.05)。第21天時，W+X+N、W+X、W+N、X+N、X、W 及 N組的硝酸氮濃度分別比對照組降低58.38%、31.66%、53.04%、53.20%、50.97%、42.61%和 14.26%。說明復合細菌對硝酸氮也有良好的去除效果。

圖3 各組硝酸氮濃度的變化Fig.3 The variation of nitrate-nitrogen concentration in different groups

2.5 不同組合的有機物去除效果

如圖4所示，第1～5天，對照組與各加菌組之間重合度高，不存在顯著性差異(P>0.05)。第 5天第 1次加菌后，第7天開始，除N組外，各加菌組COD濃度始終低于對照組，且均與對照組存在顯著性差異(P<0.05)，說明投加異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌對COD有一定的降解作用。實驗期間，W+X+N組對COD的去除效果最佳，與對照組存在極顯著差異(P<0.01)，W+X組次之。第 13天時，W+X+N組、W+X組、W+N組、X+N組、X組、W組及N組的COD濃度與對照組達到最大差異值，分別與對照組降低27.47%、23.08%、14.29%、17.58%、10.99%、8.79%和3.30%。說明復合細菌在去除無機氮的同時，對有機物也有一定去除效果。

2.6 不同組合的總氮去除效果

隨著實驗進行，各組總氮濃度緩慢上升，如圖5所示，除 N組外，其余各加菌組總氮濃度均低于對照組。整個實驗期間，W+X+N組及W+X組的總氮濃度均與對照組有極顯著差異(P<0.01)。第 15天，W+X+N、W+X、W+N、X+N、X、W及N組的總氮濃度分別比對照組降低 40.02%、29.61%、18.58%、12.34%、29.45%、11.3%和 2.65%。結果表明，3株細菌可在養(yǎng)殖環(huán)境中去除一定的總氮。

圖4 各組化學需氧量的變化Fig.4 The variation of chemical oxygen demand in different groups

圖5 各組總氮濃度的變化Fig.5 The variation of total nitrogen concentration in different groups

2.7 不同實驗組中圓斑星鰈的存活情況

實驗初始，各養(yǎng)殖箱中放入圓斑星鰈10尾。第21天，對照組出現大量死亡現象。如表3所示，圓斑星鰈存活數量分別為4、5和4尾，存活率為40%、50%和 40%，隨即停止實驗。各加菌組除 W 組、N組、X+N組出現少量死亡外，其余組均無死亡現象。表明添加的 3株異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌對圓斑星鰈無毒害及致病作用，并通過改善水體環(huán)境保證了圓斑星鰈的存活率。

3 討論

研究結果顯示，與未添加異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌的對照組相比，W+X+N組合對氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮、總氮及化學需氧量的去除效果優(yōu)于其他組合，分別低于對照組68.55%、48.36%、58.38%、40.02%及27.47%，該組合與趙留群等(2014)投加EM菌實驗結果相比，對氨氮和亞硝酸氮去除率分別提高了11.63%和 166.01%，與鄭佳佳等(2013)復合菌實驗結果相比，硝酸氮的去除率提高了3.16%。預示這些菌構成的復合異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌菌劑能有效地降低水體中氮素含量，改善水質。各種無機氮指標基本可維持在較低水平，滿足養(yǎng)殖的水質要求，在海水養(yǎng)殖生產上具有很好的應用前景。

表3 不同實驗組中圓斑星鰈的存活率Tab.3 The survival rate of V. variegatus in different experimental groups

3株細菌對化學需氧量有一定的去除作用，雖然最大去除率僅為27.47%，不及馬夢雪等(2016)利用硝化細菌和反硝化細菌的復合菌劑處理模擬污水的效果，但優(yōu)于自養(yǎng)硝化細菌，且3株細菌對COD的去除僅為輔助功能，相對于傳統(tǒng)異養(yǎng)反硝化菌而言，不但不需添加額外碳源，反而可消除原有的有機物。

花津灘芽孢桿菌(SLWX2)和嗜堿鹽單胞菌(X3)對各項指標的去除效果均優(yōu)于麥氏交替單胞菌(SLNX2)，這與 3株細菌前期進行的脫氮特性研究所取得的結果一致。同時，相同接種濃度、不同細菌組合對氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮、總氮及化學需氧量均有去除作用，但去除效果不一?？傮w而言，3株菌復合組優(yōu)于2株菌復合組，并優(yōu)于單株菌組，說明3株細菌復合之后有很好的協同作用，但協同作用效果不一。

3株細菌對硝酸氮和總氮均有去除效果，3株細菌在實際生產中可起到反硝化作用。為探究脫氮細菌反硝化機制，黃廷林等(2014)利用PCR技術從3株好氧反硝化細菌中均成功檢測到周質硝酸鹽還原酶亞基基因(napA)，表明其可以利用napA還原硝酸氮實現反硝化功能。Li等(2012)利用斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)T13對硝酸鹽還原酶進行檢測，檢測到硝酸鹽還原酶占脫氮酶基因的30%以上。目前，被分離篩選出的眾多異養(yǎng)硝化–好氧反硝化細菌均能實現生物脫氮功能，但不同種類菌株在脫氮途徑和酶學特征上有較大的差異(吳偉等, 2013; 李嘉偉等, 2015; 李鵬章等, 2015)。此外，本研究3株細菌的脫氮途徑和機制尚不清楚，3株細菌組合效果最優(yōu)的原因可能為3株細菌存在的脫氮酶系不同，具有互補作用，下一步需要通過分子生物學技術，對其相關基因進行深入研究，探究3株細菌的脫氮途徑與機制，來加以驗證。

4 結論

3株細菌在養(yǎng)殖環(huán)境中均具有硝化–反硝化作用，可實現生物脫氮功能，但對圓斑星鰈養(yǎng)殖水質各項指標的去除效果不一，其中，SLWX2單株效果最佳。組合菌效果好于單株菌，其中，SLWX2+X3+SLNX2組合對圓斑星鰈養(yǎng)殖水質凈化效果最佳，可使養(yǎng)殖水體3種無機氮的濃度維持在較低范圍，SLWX2+X3組合凈化效果次之。3株細菌對圓斑星鰈生長無毒害作用，使用安全。

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