劉 明，劉熙鵬

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 張家口 075061)

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

瑞舒伐他汀鈣購于浙江京新藥業(yè)有限公司，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，并制成濃度為2×103μmol/L的瑞舒伐他汀母液，并根據(jù)實驗要求利用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋；兔抗人MMP2、MMP9、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、β-catenin及GAPDH多克隆抗體均購于美國Abcam公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Transwell小室均購于美國Gibco公司；BCA蛋白測定試劑盒、CCK-8試劑盒均購于南京凱基生物技術(shù)有限公司。

DYCZ-425D型雙垂直電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購于北京六一儀器廠；GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購于美國伯樂公司；168-1000XC型酶標(biāo)儀均購于美國BD公司；AF6000型熒光顯微鏡購于德國萊卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將5×103個U87細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h，加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀作用24、48、72 h，加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h后，利用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處的OD值，每組平行3個復(fù)孔。

1.3.2 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

將8×103個U87細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，于6孔板底部用記號筆劃線，再用200 μL的槍頭對6孔板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行劃痕，接著用PBS洗去脫落下來的細(xì)胞，加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照并每孔選取4個視野進(jìn)行劃痕距離的記錄。

1.3.3 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力

實驗前將Matrigel膠均勻地平鋪于Transwell小室微膜上，備用。將8×103個U87細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h后，加入0、5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀培養(yǎng)48 h后，消化細(xì)胞并制成單懸液，接種到Transwell上室，而下室僅加入DMEM培養(yǎng)基，48 h后，將Transwell小室取出來，用多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，并于倒置顯微鏡下觀察，對5個視野中的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，并取平均值，即為細(xì)胞的侵襲數(shù)目。

根據(jù)對泰煤家園的調(diào)查與研究，利用優(yōu)勢理論和參與式發(fā)展理論，實現(xiàn)群策群力、共享共治的目標(biāo)。最終落腳到民生民情關(guān)懷上，以此重喚居民自豪感，重拾工人自信心。

1.3.4 Western blot檢測細(xì)胞中MMP2、MMP9及Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞并裂解，離心收獲上清液即是總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度，制作濃縮膠和分離膠，蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜。2%的BSA室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔MMP2、MMP9、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、β-catenin及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)4℃過夜孵育，次日室溫條件下二抗溶液孵育1～2 h，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，隨著作用時間延長，5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組細(xì)胞活力逐漸降低(P< 0.01)，且隨著給藥濃度增加，細(xì)胞活力也逐漸降低(P< 0.01)，見表1。

2.2 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

與對照組比較，5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著降低(P< 0.01)，見圖1、圖2及表2。

2.3 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)的影響

與對照組比較，5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組MMP2及MMP9表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01)，見圖3。

2.4 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，5 μmol/L組、10 μmol/L組、20 μmol/L組中Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01)，見圖4。

3 討論

瑞舒伐他汀是20世紀(jì)80年代合成得到的一種新型他汀類降脂藥物，能夠抑制內(nèi)皮素、NO的合成與釋放，減少自由基生成，能夠改善動脈內(nèi)皮功能，能夠防治動脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生，最終減少心血管疾病的發(fā)生[4-5]。瑞舒伐他汀對肝細(xì)胞具有很強的親和力，且與其它藥物之間作用小，是目前常用的心腦血管二級預(yù)防藥物[4-5]，且近些年來研究還發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀對乳腺癌、肺癌、乳頭狀甲狀腺癌、胰腺癌及肝癌等腫瘤具有顯著療效[9-10]，同時研究還發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著毒性[6]，但具體作用機制未知。另外研究報道證實瑞舒伐他汀能夠顯著抑制高半胱氨酸及PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移[7-8]，提示瑞舒伐他汀可能對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移及侵襲具有抑制作用，因此本研究對此展開了探討。

Tab.1Effect of rosuvastatin on the viability of U87 cells

組別Groups24h48h72h對照組Controlgroup0486±00500612±00610728±00735μmol/L組5μmol/Lgroup0442±0044??0520±0052??0542±0054??10μmol/L組10μmol/Lgroup0396±0040??0443±0044??0451±0045??20μmol/L組20μmol/Lgroup0336±0030??0351±0035??0358±0036??

注：與對照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：對照組；B：5 μmol/L組；C：10 μmol/L組；D：20 μmol/L組。圖1 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞遷移能力的影響(× 200)Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group.Fig.1 Effect of rosuvastatin on the migration ability of U87 cells

注：A：對照組；B：5 μmol/L組；C：10 μmol/L組；D：20 μmol/L組。圖2 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞侵襲能力的影響(× 200)Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group.Fig.2 Effect of rosuvastatin on the invasion ability of U87 cells

Tab.2Effect of rosuvastatin on the migration and invasion abilities of U87 cells

組別Groups遷移距離(μm)Migrationdistance侵襲數(shù)目Numberofmigratedcells對照組Controlgroup2031±23115968±15．975μmol/L組5μmol/Lgroup1557±105??9854±9．85??10μmol/L組10μmol/Lgroup834±084??7146±7．14??20μmol/L組20μmol/Lgroup351±035??4238±4．23??

注：與對照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01.

注：A：對照組；B：5 μmol/L組；C：10 μmol/L組；D：20 μmol/L組。與對照組比較，**P< 0.01。圖3 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中MMP2及MMP9表達(dá)的影響Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.3 Effect of rosuvastatin on the expression of MMP2 and MMP9 in U87 cells

注：A：對照組；B：5 μmol/L組；C：10 μmol/L組；D：20 μmol/L組。與對照組比較，**P< 0.01。圖4 瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note. A: Control group; B: 5 μmol/L group; C: 10 μmol/L group; D: 20 μmol/L group. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.4 Effect of rosuvastatin on the expression of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins in U87 cells

本研究首先采用CCK-8法檢測瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87活力的影響，結(jié)果表明瑞舒伐他汀能顯著降低U87細(xì)胞活力，并具有劑量及時間依賴性，與Tapia-Pérez等[6]的研究一致。膠質(zhì)瘤細(xì)胞的快速增殖、侵襲是患者術(shù)后失敗的主要原因之一[11]。而細(xì)胞外基質(zhì)的降解為腫瘤細(xì)胞快速進(jìn)出細(xì)胞提供足夠空間，這一過程主要由蛋白水解酶MMPs介導(dǎo)。MMPs是一類依賴于Zn2+的蛋白水解酶，主要分為四類，其中明膠酶MMP2和MMP9不僅能夠降解基膜主要成分IV膠原、層連蛋白等，還能夠誘導(dǎo)血管新生，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤擴散。目前研究證實高表達(dá)的MMP2、MMP9與膠質(zhì)瘤的高侵襲性正相關(guān)，且患者生存結(jié)果差[12]。說明通過降低MMP2和MMP9表達(dá)，能夠顯著降低膠質(zhì)瘤侵襲并提高患者生存能力。而且Gan等[7]研究表明瑞舒伐他汀能夠通過下調(diào)MMP2、MMP9表達(dá)進(jìn)而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移，Shi等[8]研究表明瑞舒伐他汀能夠通過下調(diào)MMP2表達(dá)進(jìn)而抑制高半胱氨酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移，提示瑞舒伐他汀對MMP2及MMP9表達(dá)具有調(diào)控作用，所以本研究利用Western blot檢測瑞舒伐他汀對U87細(xì)胞中MMP2和MMP9表達(dá)的影響，結(jié)果表明瑞舒伐他汀能顯著降低MMP2和MMP9表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的遷移與侵襲。

膠質(zhì)瘤的高侵襲性受多種信號通路的調(diào)控，Wnt信號通路就是最為重要的一種[13-14]。Wnt屬于原癌基因，包括20種亞族，不僅參與胚胎的發(fā)育過程，還在炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。Wnt通過四條信號通路將外界刺激傳遞到靶細(xì)胞，并使細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)。其中Wnt/β-catenin信號通路是其經(jīng)典通路，β-catenin是此通路的核心分子，正常生理條件下，β-catenin處于細(xì)胞質(zhì)中，與Axin、APC及GSK-3β等形成復(fù)合物，當(dāng)Wnt被激活后，Wnt與Frizzled形成復(fù)合物激活A(yù)xin，使β-catenin從復(fù)合物中解離出來并在細(xì)胞漿中積聚，最后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與TCL/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，刺激MMPs、CyclinD1、c-myc等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[15]。研究表明Wnt/β-catenin信號通路在膠質(zhì)瘤中高度激活并上調(diào)(包括Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin)，并與膠質(zhì)瘤的高侵襲性密切相關(guān)[13-14]。因此抑制Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，有助于降低膠質(zhì)瘤的侵襲性。所以本研究進(jìn)一步探討瑞舒伐他汀對膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的影響，結(jié)果表明瑞舒伐他汀能顯著抑制U87細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、Wnt7a及β-catenin表達(dá)，從而下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá)，最終抑制細(xì)胞的遷移與侵襲。

綜上所述，5、10、20 μmol/L的瑞舒伐他汀能顯著降低U87細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞遷移與侵襲能力，并下調(diào)MMP2及MMP9表達(dá)，此過程與阻斷Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。在今后的實驗研究中，本課題組將會深入探索瑞舒伐他汀對人體膠質(zhì)瘤的作用機制，期望研究成果為臨床應(yīng)用提供理論與實驗基礎(chǔ)，并為膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新的選擇。

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