溫云杰，宋書會，張金堯，劉榮樂，汪 洪*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/耕地培育技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

土壤磷素分為無機(jī)磷和有機(jī)磷兩大類。無機(jī)磷主要有礦物態(tài)、吸附態(tài)和水溶態(tài)。礦物態(tài)磷包括含磷的原生礦物磷灰石、次生礦物磷鋁石和粉紅磷鐵礦及其他含磷化合物。植物吸收的磷主要是土壤溶液中的磷酸鹽。一定條件下土壤中不同形態(tài)磷發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[1-2]。同位素示蹤技術(shù)是研究生態(tài)系統(tǒng)中元素循環(huán)與形態(tài)轉(zhuǎn)化的重要工具。磷元素有23種同位素，分別從24P到46P。31P是唯一的穩(wěn)定同位素，所以無法直接利用穩(wěn)定性磷同位素開展磷示蹤研究[3]。自然界中氧原子存在18O、17O和16O三種穩(wěn)定性同位素，豐度分別為0.204%、0.037%和99.76%。氧同位素自然豐度組成用δ18O表示，定義為:式中：Rsample為樣品18O/16O原子豐度比值；RVSMOW是維也納標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水 (Vienna standard mean ocean water) 的18O/16O原子豐度比值。

磷酸鹽中磷原子通過共價鍵與四個氧原子相連，P—O鍵能較高，自然條件下穩(wěn)定，沉淀溶解、吸附解吸等過程中不易導(dǎo)致P—O鍵斷裂[4]，利用磷酸鹽中氧穩(wěn)定性同位素可以示蹤表征生態(tài)系統(tǒng)中磷的轉(zhuǎn)化。

微生物、磷酸酶催化等生物反應(yīng)，可使磷酸鹽與周圍水中氧發(fā)生交換，導(dǎo)致磷酸鹽中氧同位素(δ18O-P) 出現(xiàn)分餾[5-7]。Longinelli等[8]發(fā)表了磷酸鹽和周圍水體間氧同位素交換平衡分餾系數(shù)與溫度的關(guān)系式 T = 111.4 - 4.3 (δ18O-P-δ18O-H2O)，式中，T 代表海水溫度，δ18O-P和δ18O-H2O分別代表磷灰石中磷酸鹽和周圍水中氧同位素組成。根據(jù)實(shí)測溫度和δ18O-H2O，計(jì)算出磷酸鹽δ18O-P平衡值。若δ18O-P實(shí)測值與計(jì)算值接近，說明磷酸鹽和周圍水分子間氧同位素越接近平衡分餾，即生物對磷利用轉(zhuǎn)化率越高。McLaughlin等[9-12]采用Mg(OH)2-PO4共沉淀法(MAGIC共沉淀法) 富集提取水體中磷酸鹽，再利用CePO4沉淀分離純化，最終得到磷酸銀沉淀，利用元素分析儀—穩(wěn)定性同位素比例質(zhì)譜儀測試磷酸鹽中氧同位素。

磷素化學(xué)連續(xù)浸提分級方法研究土壤中磷素的形態(tài)和有效性，對揭示和評價土壤磷庫大小和土壤磷供應(yīng)狀況具有重要意義[1-2]。Zohar等[13]利用H2O、NaHCO3、NaOH和HCl提取土壤中不同形態(tài)無機(jī)磷，采用MAGIC共沉淀法分離磷酸鹽，每級無機(jī)磷分別沉淀為Ag3PO4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)磷酸鹽δ18O-P值存在差異。鹽酸提取的磷酸鹽主要是石灰性土壤中磷灰石和部分閉蓄態(tài)磷，難以直接被作物吸收利用，但在根系分泌物和土壤微生物的作用下，可以被轉(zhuǎn)化利用[1-2]。Tamburini等[14]采用以磷酸鉬銨和磷酸銨鎂先后沉淀-溶解-沉淀的方法 (APM-MAP多步沉淀法) 得到純凈Ag3PO4，對HCl提取的土壤磷酸鹽氧同位素進(jìn)行分析，該方法有效排除了有機(jī)磷酸鹽水解的干擾，并采用DAX-8樹脂進(jìn)一步吸附溶解液中可能殘余的有機(jī)質(zhì)。采用MAGIC共沉淀法富集HCl浸提液中磷酸鹽，強(qiáng)酸溶解后，磷酸鈰沉淀分離凈化，最終得到磷酸銀沉淀上機(jī)測試，但該法導(dǎo)致土壤中有機(jī)磷酸鹽或焦磷酸鹽發(fā)生水解，δ18O-P值明顯偏高。土壤成分復(fù)雜，利用HCl提取土壤磷酸鹽，浸提液中含酸溶性的有機(jī)質(zhì)以及非磷酸鹽含氧化合物如硫酸鹽、硝酸鹽，氧同位素來源復(fù)雜，易造成土壤δ18O-P值失真；浸提液含有豐富的Cl-離子，pH較低，干擾磷酸鹽分離純化形成Ag3PO4沉淀過程[15-16]，因此有關(guān)HCl提取的土壤磷酸鹽δ18O-P研究報(bào)道還較為有限。

本文選擇黑土和潮土的長期定位試驗(yàn)中NK (不施磷肥)、NPK (施用無機(jī)磷肥)、NPKM (施用無機(jī)磷肥 + 有機(jī)糞肥)、NPKS (NPK + 秸稈還田) 4個施肥處理土樣，按照Guppy土壤磷分級方法逐級浸提，通過對鹽酸提取磷酸鹽 (HCl-Pi) 進(jìn)行富集、純化，獲得Ag3PO4沉淀，采用元素分析儀—穩(wěn)定性同位素比例質(zhì)譜儀 (elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers，EA-IRMS) 測定其中 δ18O-P 值，建立鹽酸提取的土壤磷酸鹽中氧同位素分析技術(shù)，擬為農(nóng)田土壤中磷的循環(huán)轉(zhuǎn)化及其溯源研究提供技術(shù)支撐。

1 材料方法

1.1 供試土壤

黑土采自“國家土壤肥力和肥料效益長期監(jiān)測基地”吉林省公主嶺市試驗(yàn)點(diǎn)，作物種植模式為一年一熟玉米連作。潮土采自河南省鄭州市，作物種植模式為玉米-小麥輪作。兩處土壤樣品均采集于2015年玉米收獲期。供試土壤樣品來自4個施肥處理，分別為：1) 不施磷肥 (NK)；2) 施用無機(jī)氮磷鉀肥 (NPK)；3) NPK常量，加有機(jī)糞肥 (NPKM)；4)NPK常量，加粉碎秸稈 (NPKS)。

1.2 儀器與試劑

儀器：X射線衍射儀 (型號為Empyrean，PANalytical公司)；元素分析儀—穩(wěn)定性同位素比例質(zhì)譜儀 (型號：vario PYRO cube-IsoPrime100，Elementar Analysensysteme GmbH公司)。

試劑：硝酸銀、硝酸銨、鉬酸銨、檸檬酸、氯化鎂、氯化銨、氨水 (分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DAX-8大孔樹脂 (40～60目，Sigma-Aldrich公司)；Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)參考品 (標(biāo)準(zhǔn)參考值δ18O =21.7 ± 0.3‰，Elemental Microanalysis Ltd 公司)。

1.3 HCl-Pi提取、富集與純化

步驟1，磷酸鹽提取：準(zhǔn)確秤取一定量過2 mm篩土壤樣品于塑料瓶中，按照Guppy等[17]土壤磷分級方法，分別經(jīng)過H2O、0.5 mol/L NaHCO3、0.1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl逐級浸提，收集1 mol/L HCl的浸提液，離心，收集上清液。NK和NPK處理黑土樣品測試時，每個處理3次重復(fù)，其他處理的樣品，每個處理4次重復(fù)。

步驟2，磷鉬酸銨沉淀與溶解：參照Tamburini等[14]和Jaisi等[18]方法，向上清液中加入DAX-8大孔樹脂，振蕩過夜，分離樹脂后向溶液中加入4.2 mol/L NH4NO3溶液，50℃水浴條件下加入100 g/L鉬酸銨溶液，振蕩過夜。離心棄去上清液，沉淀用0.6 mol/L NH4NO3淋洗數(shù)次，加入檸檬酸溶液至沉淀完全溶解。

步驟3，磷酸銨鎂沉淀與溶解：向溶液中加入10 mL pH 1.0鎂溶液 (20 g NH4Cl和10 g MgCl2溶解于100 mL超純水中，用HCl調(diào)節(jié)) 至白色沉淀析出。離心，沉淀用氨水 (氨水∶超純水體積比為1∶1) 淋洗數(shù)次，沉淀用0.5 mol/L HNO3溶解，加入H+型陽離子交換樹脂，振蕩10 h，過濾。

步驟4，形成Ag3PO4沉淀：在濾液中加入2滴溴百里酚藍(lán)指示劑，用氨水和3 mol/L HNO3調(diào)節(jié)溶液pH 8.0，加入AgNO3溶液，得到黃色Ag3PO4沉淀，沉淀用超純水洗滌離心數(shù)次。

步驟5，Ag3PO4純化：加入15% H2O2浸泡過夜，離心，沉淀用超純水洗滌數(shù)次，加入5 mL氨水溶解沉淀，離心收集上清液，置于50℃水浴中，使NH3在高溫下緩慢揮發(fā)，至黃色Ag3PO4沉淀析出，冷卻至室溫，離心收集，超純水清洗數(shù)次，50℃下烘干。

1.4 Ag3PO4中氧同位素測定

稱取0.5 mg左右Ag3PO4樣品，包入銀舟中，放入元素分析儀 (EA) 自動進(jìn)樣器，樣品在1450℃高溫條件下裂解，釋放O原子被玻璃碳和石墨轉(zhuǎn)化為CO，CO在流速80 mL/min的He氣吹掃下進(jìn)入色譜柱，在85℃條件下與N2分離，進(jìn)入穩(wěn)定性同位素比例質(zhì)譜儀 (IRMS) 測定。質(zhì)譜CO參考?xì)庑?zhǔn)采用國際原子能機(jī)構(gòu)提供的IAEA-601標(biāo)準(zhǔn)參照品Benzoic Acid (δ18O = 23.3‰ ± 0.3‰)。儀器 EA 工作條件：He載氣壓力0.2 MPa，CO解吸溫度110℃。IRMS工作條件：電壓3.117 V，電流1.5 mA，CO參考?xì)庑盘?2.6 nA。利用EA-IRMS對Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了6次測量，測定結(jié)果為δ18O = 21.7‰ ± 0.2‰，與標(biāo)準(zhǔn)參考值 δ18O = 21.7‰ ± 0.3‰ 接近，EA-IRMS 實(shí)驗(yàn)條件滿足樣品δ18O測定要求。

1.5 實(shí)驗(yàn)獲得的Ag3PO4純度測定

參照Tamburini等[14]方法，利用EA-IRMS分別測量實(shí)驗(yàn)獲得的Ag3PO4樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中氧元素含量，比較兩者氧元素含量是否存在差異，從而驗(yàn)證分離得到Ag3PO4樣品純度。

采用X射線衍射儀 (XRD) 測定實(shí)驗(yàn)獲得Ag3PO4樣品的礦物結(jié)構(gòu)特征，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較，進(jìn)一步檢驗(yàn)Ag3PO4樣品純度。XRD工作條件：電壓40 kV，電流40 mA，粉末多晶衍射方式為連續(xù)掃描模式，測量角度5.000°～65.0054°。

1.6 全流程氧同位素分餾檢測

按照McLaughlin等[9]和陳志剛等[19]方法，吸取10 mL 100 mg/L的KH2PO4溶液，加入AgNO3直接形成Ag3PO4沉淀。同時吸取10 mL上述KH2PO4溶液，按照HCl-Pi提取、富集與純化等步驟獲得Ag3PO4沉淀，測定此Ag3PO4沉淀的δ18O值，與直接形成Ag3PO4沉淀的δ18O值比較，檢驗(yàn)磷酸鹽分離流程中氧同位素是否出現(xiàn)分餾。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤磷酸鹽的磷回收率

HCl提取土壤磷酸鹽富集、分離與純化流程包括磷鉬酸銨沉淀與溶解、磷酸銨鎂沉淀與溶解、Ag3PO4沉淀3個重要步驟。表1結(jié)果表明，這3個實(shí)驗(yàn)步驟中磷回收率均在92%以上，回收率較高，說明實(shí)驗(yàn)步驟中磷分離轉(zhuǎn)化較完全，降低了實(shí)驗(yàn)流程造成磷酸鹽氧同位素分餾的可能。

表1 HCl提取土壤磷酸鹽的富集、分離與純化實(shí)驗(yàn)室過程中磷回收率Table 1 Recovery rate and relative standard deviation (RSD) of inorganic phosphate during the process of HCl-Pi extraction and purification, Ag3PO4 precipitation

2.2 Ag3PO4純度

2.2.1 XRD檢測 本實(shí)驗(yàn)獲得的Ag3PO4測定XRD譜圖，與Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)譜圖 (譜庫中編號02-070-0702)比較，十分吻合，說明本實(shí)驗(yàn)得到的Ag3PO4樣品純度較高 (圖1)。

圖1 磷酸銀沉淀樣品的X射線衍射譜圖Fig. 1 X-ray diffraction diagrams of Ag3PO4 obtained from HCl-Pi

2.2.2 氧元素含量分析 稱取不同量的經(jīng)過分離純化獲得的Ag3PO4樣品，利用EA-IRMS測定，以裂解產(chǎn)生的氧元素含量 (以CO峰高計(jì)) 與樣品量之間作圖，并與Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)品做比較 (圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)提取的Ag3PO4樣品裂解產(chǎn)生的氧元素含量與樣品測定量間呈較好的線性關(guān)系 (R2=0.999，n = 36)，表明本實(shí)驗(yàn)提取的Ag3PO4樣品中氧元含量組成比例和Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)品吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)步驟獲取的Ag3PO4純度較高。

圖2 利用元素分析儀測定HCl-Pi分離純化獲得Ag3PO4樣品與Ag3PO4標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的CO量與樣品量之間的線性相關(guān)圖Fig. 2 Weight of analyte plotted against the CO peak area for Ag3PO4 standard and samples obtained from HCl-Pi

2.3 實(shí)驗(yàn)流程中磷酸鹽氧同位素分餾判斷

利用KH2PO4溶液直接與AgNO3反應(yīng)形成Ag3PO4沉淀，測定其 δ18O-P 值為 (6.82 ± 0.26)‰(n = 4)。KH2PO4溶液通過磷鉬酸銨沉淀與溶解、磷酸銨鎂沉淀與溶解及Ag3PO4沉淀純化等實(shí)驗(yàn)流程形成 Ag3PO4沉淀，δ18O-P 值為 (6.73 ± 0.11)‰ (n = 4)，兩者絕對相差0.09‰，無顯著性差異，表明HCl-Pi在分離純化全流程中沒有產(chǎn)生氧同位素分餾。

Tamburini等[14]向HCl提取土壤樣品磷酸鹽中加入18O標(biāo)記水，示蹤磷酸鹽通過APM-MAP多步沉淀法得到純凈磷酸銀過程中是否發(fā)生氧同位素分餾，結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)過程未出現(xiàn)同位素分餾。

2.4 黑土和潮土HCl-Pi的δ18O-P結(jié)果

從圖3結(jié)果可知，黑土與潮土各施肥處理中HCl-Pi的δ18O-P依次為16.91‰和17.90‰ (NK)、17.25‰和 17.61‰ (NPK)、17.62‰和 17.87‰ (NPKM)、17.90‰和17.70‰ (NPKS)，各個處理間δ18O-P均無顯著差異。瑞士與以色列兩地不同施肥處理的HCl提取土壤磷酸鹽δ18O-P值為13.5‰～17.6‰，農(nóng)田土壤中磷酸鹽δ18O-P相對富集，為19‰左右[14]。采用APM-MAP多步沉淀法富集純化HCl提取的土壤磷酸鹽，通過H2O2漂洗去除有機(jī)質(zhì)，輔以氨水重結(jié)晶去除Ag3PO4中夾雜的Ag2O和Ag等雜質(zhì)，測定廈門集美地區(qū)森林、公園和農(nóng)田HCl提取土壤磷酸鹽δ18O-P值在15.2‰～19.5‰之間[20]。Amelung等[21]采用APM-MAP多步沉淀法，富集提取德國施用礦質(zhì)磷肥和有機(jī)肥的土壤HCl浸提磷酸鹽。發(fā)現(xiàn)有機(jī)糞肥δ18O-P值較化學(xué)磷肥低，可能導(dǎo)致長期施用有機(jī)糞肥土壤 δ18O-P 值 (17.2‰ ± 2.23‰) 低于化學(xué)磷肥施用的土壤 (19.8‰ ± 0.56‰)，長期施肥條件下，土壤磷酸鹽供給主要來源于肥料。

3 結(jié)論

連續(xù)浸提土壤后，利用1 mol/L HCl土壤浸提液，對浸提液中磷酸鹽采用磷酸鉬銨和磷酸銨鎂先后沉淀-溶解-沉淀方法進(jìn)行提取純化，獲得磷酸銀沉淀，關(guān)鍵過程中磷回收率均在92%以上，磷酸鹽損失較少；XRD和氧含量測定表明，磷酸銀沉淀純化效果較好。分離純化過程中未出現(xiàn)氧同位素分餾。測定供試黑土與潮土HCl-Pi的δ18O-P分別為16.91‰和 17.90‰ (NK)、17.25‰和 17.61‰(NPK)、17.62‰和 17.87‰ (NPKM)、17.90‰和17.70‰ (NPKS)。本研究建立了鹽酸提取的土壤磷酸鹽中氧同位素分析測定方法，為農(nóng)田土壤中磷的循環(huán)轉(zhuǎn)化及其溯源研究提供技術(shù)支撐。

圖3 長期施肥處理黑土和潮土HCl浸提土壤磷酸鹽δ18O-PFig. 3 Isotopic oxygen composition (δ18O-P) of inorganic phosphate extracted by HCl from the soils under long-term fertilization

參 考 文 獻(xiàn)：

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