曲宏偉，吳鐵成，何云梅，高 娃，趙存發(fā)，李玉榮，劉 斌*，趙生國

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.內(nèi)蒙古蒙絨絨山羊產(chǎn)業(yè)研究院，內(nèi)蒙古 阿拉善 750306;4.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗家畜改良工作站，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯016100)

阿拉善型絨山羊是荒漠草原牧區(qū)的主要畜種之一，具有適應(yīng)能力強(qiáng)、羊絨品質(zhì)好等特點(diǎn)。阿拉善型絨山羊羊絨細(xì)度在同類產(chǎn)品中獨(dú)具優(yōu)勢，但其長期生存在荒漠草原地區(qū)，缺乏良好的管理?xiàng)l件，所以生產(chǎn)能力較低[1]。因此，為了提高該種羊的生產(chǎn)能力，增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，就需要改進(jìn)生產(chǎn)方式。人工授精在現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展中已經(jīng)起到了重要角色并被大力推廣，精液稀釋是人工授精的一個(gè)重要技術(shù)環(huán)節(jié)，原精經(jīng)過稀釋后，可大幅增加授精母羊的數(shù)量，提高種公羊的利用率[2]。目前，在山羊的人工授精技術(shù)方面，鮮精配種的效果要顯著優(yōu)于凍精[3]，但鮮精保存的時(shí)間都不是很長。所以擁有良好的精液稀釋液就顯得尤為重要。

精液稀釋液需滿足精子必須的生存條件，延長精子在體外存活的時(shí)間，增強(qiáng)精子活率，從而利于精子的保存和運(yùn)輸[4]。本試驗(yàn)通過對比幾種常用稀釋液對精液保存效果的差異，篩選出保存效果較好的稀釋液配方并進(jìn)行改進(jìn)，通過篩選不同pH及不同蔗糖濃度的精液稀釋液對精子活率的影響，為精液的保存效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用精液采自阿拉善白絨山羊種羊場的3只配種用白絨山羊，年齡均為2歲，身體狀況良好。在配種期正常放牧，自由飲水，同時(shí)每只公羊每天補(bǔ)飼精料1.2～1.5 kg。

1.2 試驗(yàn)藥品及器材

葡萄糖，D-果糖，檸檬酸鈉，檸檬酸，EDTA，Tris，青霉素，卵黃，超純水，蔗糖，電子天平，燒杯，錐形瓶，顯微鏡，酸度計(jì)，移液管。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

2016年10月1日至2016年11月10日，在內(nèi)蒙古某白絨山羊種羊場配種期開展試驗(yàn)。

1.4 稀釋液配方

試驗(yàn)初期所采用的4種配種常用精液稀釋液配方A1～A4來源于種羊場常用配方及陜北白絨山羊會議記錄，其配方成分見表1。經(jīng)過初次試驗(yàn)后，在所篩選的精液稀釋液配方的基礎(chǔ)上對其pH進(jìn)行調(diào)整，pH分別為6.7、6.5和6.3，其精液稀釋液配方B1～B3見表2。再次試驗(yàn)后，對所得出的最適pH的精液稀釋液配方進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的精液稀釋液配方C1～C3見表3。在稀釋液配制過程中，應(yīng)先將稱量好的藥品放入錐形瓶中，再加入100 mL超純水，最后加入青霉素，所有稀釋液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 生產(chǎn)上常用的4種精液稀釋液配方Table 1 Production of commonly used 4 kinds of semen diluent formula

表2 不同pH的精液稀釋液配方Table 2 Different pH of semen diluent formula

表3 改進(jìn)后的精液稀釋液配方Table 3 Improved semen diluent formula

1.5 精液的采集與處理

采用假陰道采集法進(jìn)行采精。將采到的精液在室溫下進(jìn)行活率檢測，然后等量分裝于滅菌的離心管內(nèi)，按照1∶4[2]加入相應(yīng)的精液稀釋液進(jìn)行稀釋，并編號標(biāo)記，然后將精液置于保溫桶內(nèi)(10～25 ℃)保存。每4～6 h翻動一次離心管，防止精子沉淀。從稀釋完精液開始，每6 h進(jìn)行一次活率檢測，直至最后一份精液活率低于0.3為止。

1.6 效果判定

精子活率為視野中直線運(yùn)動的精子占視野中總精子數(shù)的百分比；每次鏡檢精子活率，隨機(jī)觀察4個(gè)視野，檢測視野中直線運(yùn)動的精子數(shù)占總精子數(shù)的比例，求其平均值作為精子活率；每只羊三次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理后，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 常用精液稀釋液配方的篩選

常用的4種精液稀釋液對精子活率的影響結(jié)果見表4，試驗(yàn)12 h之前4組精子活率差異不顯著(P>0.05)。18h～24 h，A2組與A3組活率顯著高于其他兩組(P<0.05)。36 h之后，A2組精子活率顯著(P<0.05)高于其他三組。

2.2 不同pH對精子活率的影響

不同pH精液稀釋液配方篩選結(jié)果見表5，試驗(yàn)6 h之前及30 h～42 h之間三組精子活率差異不顯著(P>0.05)；在12 h～24 h之間及48 h～60 h之間B3組精子活率顯著高于其他兩組(P<0.05)。

表4 不同稀釋液對精子活率的影響Table 4 Effects of different semen dilutions on sperm motility

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不標(biāo)或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: Different letters in the same row indicate significant differences (P<0.05), no letter or the same letter indicate insignificant difference(P>0.05). The same below.

表5 不同pH對精子活率的影響Table 5 Effects of different pH on sperm motility

2.3 改進(jìn)后的精液稀釋液對精子活率的影響

從表6可以看出，6 h之前三組精子活率差異不顯著(P>0.05)；12 h～72 h之間C2組和C3組精子活率顯著高于C1組(P<0.05)；而C2組和C3組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 三組配方中最優(yōu)組精子活率對比

在圖1中，通過將三種精液稀釋液各組中最優(yōu)的一種配方效果進(jìn)行比較可見，雖然短時(shí)間內(nèi)各稀釋液之間精子活率差異不明顯，但隨時(shí)間延長，優(yōu)化后的精液稀釋液中精子的活率及存活時(shí)間已明顯超過原精液稀釋液。

圖1 三組配方中最優(yōu)組精子活率對比Fig.1 Comparison of sperm motility in optimal group of 3 groups

保存時(shí)間/hStoragetime稀釋液SemendiluentC1C2C300．85±0．050．84±0．070．83±0．0760．81±0．070．84±0．070．83±0．06120．74b±0．050．81a±0．070．81a±0．05180．71b±0．050．80a±0．060．78a±0．06240．69b±0．050．78a±0．060．76a±0．07300．65b±0．050．74a±0．050．73a±0．07360．63b±0．080．72a±0．060．70a±0．07420．57b±0．090．68a±0．060．69a±0．08480．53b±0．080．68a±0．070．67a±0．10540．51b±0．070．64a±0．070．65a±0．09600．48b±0．060．63a±0．070．63a±0．08660．44b±0．080．58a±0．060．57a±0．07720．40b±0．070．52a±0．070．50a±0．07780．28±0．100．33±0．080．33±0．06840．09±0．140．11±0．160．09±0．14

3 討 論

精子活率是評價(jià)稀釋液效果的重要指標(biāo)，是保證精子通過雌性生殖道并使卵子受精的重要條件[5]，本次試驗(yàn)根據(jù)精子活率的情況，對四種不同的常用精液稀釋液效果進(jìn)行評定，可以看出A2組稀釋液的效果明顯要優(yōu)于其他各組稀釋液(P<0.05)。而將這四組常用稀釋液進(jìn)行pH測定后發(fā)現(xiàn)A2組的pH為6.5，其他三組分別為6.8，7.0，7.4，可以看出A2的pH相比其他三組偏酸性，從而以A2組稀釋液為基礎(chǔ)，對其配方成份進(jìn)行pH優(yōu)化改進(jìn)。

新鮮精液的pH一般為中性偏堿，當(dāng)pH低于這個(gè)范圍時(shí)，精子的活動及新陳代謝都會降低。大多數(shù)精液稀釋液中高濃度的葡萄糖能使pH降至6.0以下，這種酸性環(huán)境可以延長精子的體外保存時(shí)間[6]。但是稀釋液中的pH超出一定的酸度范圍，則容易引起精子死亡，所以稀釋液中需添加適量的緩沖劑來調(diào)節(jié)pH[7]。而將EDTA作為緩沖劑加入稀釋液中，也有利于精子的保存[8]。在本次試驗(yàn)中，通過調(diào)節(jié)精液稀釋液的pH來觀察不同pH對精子活率的影響，發(fā)現(xiàn)pH為6.3的B3組的精子活率要優(yōu)于其他兩組(P<0.05)，所以可以看出偏酸性的外界環(huán)境更容易保持精子活率及延長山羊精子的存活時(shí)間，然后再以B3組稀釋液為基礎(chǔ)，再進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)。

糖類是精液稀釋液中的重要成分，精子主要通過糖酵解途徑產(chǎn)生能量來維持細(xì)胞的新陳代謝及鞭毛運(yùn)動，這些能量主要是由稀釋液中的葡萄糖提供[9]。并且糖類還能夠在細(xì)胞的親水組織中替代水分子，這一特性在溫度變化過程中保護(hù)細(xì)胞膜起到重要作用[10]。研究表明，高濃度的葡萄糖能夠提高精子活率，但是高濃度的蔗糖等雙糖對精子活率的提高也有作用[11]。本試驗(yàn)中，采用在篩選出的稀釋液中添加蔗糖對精液稀釋液進(jìn)行改進(jìn)，其效果要優(yōu)于之前的稀釋液，尤其是蔗糖濃度為12 mg/mL和18 mg/mL的C2組和C3組，精子存活時(shí)間及精子活率均大于原稀釋液。有研究顯示，雖然蔗糖單獨(dú)添加于稀釋液對精子的保存效果較差，但與其他糖類混合后對于精子的保存效果要優(yōu)于未混合組[12]，這與本次試驗(yàn)所得出的結(jié)論相同。因本次試驗(yàn)條件有限，只添加了蔗糖一種糖類進(jìn)行改進(jìn)，若在稀釋液中再添加海藻糖等其他糖類，效果可能會更好，這有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本次試驗(yàn)結(jié)果與其他相關(guān)試驗(yàn)[3，13]相比，精子的保存時(shí)間及活率也有了較高的提升。為在草原牧場上更加高效的利用優(yōu)質(zhì)種公羊，提高精子活率和延長精子保存時(shí)間是非常必要的。這對于草原上距離較遠(yuǎn)的羊場之間進(jìn)行人工授精提供了很大的方便，既不需要冷凍精液復(fù)雜的設(shè)備，又保障了所提供精子的活率。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，阿拉善型白絨山羊精液稀釋液的最佳pH為6.3，最優(yōu)蔗糖濃度為12～18 mg/mL。最優(yōu)配方為：葡萄糖3.00 g、檸檬酸鈉1.40 g、EDTA0.12 g、蔗糖1.8 g、青霉素20萬U、卵黃10 mL，超純水100 mL。本次試驗(yàn)所在地處于偏遠(yuǎn)地區(qū)，試驗(yàn)條件及設(shè)備有限，對精子的保存產(chǎn)生不利影響。但是從試驗(yàn)的整體效果來看，已經(jīng)起到了改進(jìn)常規(guī)精液稀釋液的目的，這將有利于阿拉善牧區(qū)絨山羊的人工授精及種公羊的利用率，對于較遠(yuǎn)距離羊場之間精液的運(yùn)輸和人工授精提供了可靠保障。

[1] 張文彬, 楊萬有, 張震宇. 阿拉善型白絨山羊的選育提高及推廣[J]. 中國畜牧雜志, 1990(5):33-34.

[2] 滿都拉. 精液稀釋倍數(shù)對精子活率及母羊受胎率的影響[J]. 當(dāng)代畜牧, 2014(8):65-66.

[3] 韓天龍, 李清泉,毛冉,等. 羊精液稀釋保存液的篩選[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2015, 47(9):45-47.

[4] 祡捷.公豬精液品質(zhì)的影響因素及改進(jìn)措施[J]. 中國豬業(yè), 2016, 11(11):72-74.

[5] 張婷.四種糖類對豬精液冷凍保存效果的研究[D].陜西楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[6] JOHNSON L A , WEITZE K F , FISER P , et al.Storage of boar semen[J]. Animal Reproduction Science,2000,62：143-172.

[7] 張忠誠.家畜繁殖學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)山版社, 2000:155-182.

[8] OLLERO M , PEREZ-PE R , MUIO-BLANCO T,et al. Improvement of ram sperm cryopreservation protocols assessed by sperm quality parameters and heterogeneity analysis[J].Cryobiology,1998, 37(1):1-12.

[9] 劉玉.豬常溫精液稀釋液配方的篩選與優(yōu)化[D].陜西楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.

[10] 丁瑜.優(yōu)質(zhì)肉羊精液冷凍稀釋液的研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[11] 祝發(fā)明.波爾山羊冷凍精液稀釋液配方研究[D].陜西楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué),2003.

[12] 毛冉, 李清泉, 石劍華,等. 不同糖類稀釋液對低溫保存杜泊羊鮮精的影響[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2015(12):24-28.

[13] 王占赫,郭玉琴,周雙海,等.不同精液稀釋液常溫保存綿羊精液的效果[J]. 當(dāng)代畜牧, 2006(2):34-36.