李方舟，溫 飛，杜燁青，張利坤，白秦生，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省秦勝牧業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 扶風(fēng) 7222064)

人工授精技術(shù)(Artificial insemination, AI)可提高和保障羊的繁殖效率，促進(jìn)良種羊的繁育，是一種已被大范圍推廣和應(yīng)用的現(xiàn)代繁殖技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)羊產(chǎn)業(yè)工業(yè)化、集約化奠定基礎(chǔ)[1]。人工授精技術(shù)的關(guān)鍵則是精液的稀釋保存。在實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖企業(yè)多采用羊精液低溫保存技術(shù)[2]。鄭丕留等[3]研究發(fā)現(xiàn)，羊精液在3～5 ℃時(shí)精子活力最佳。孟娜娜等[4]在綿羊精液低溫保存試驗(yàn)中，用大豆卵磷脂代替卵黃，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加濃度為0.375%時(shí)保存效果最好。陳宗明等[5]在山羊精液低溫保存試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加維生素C能有效提高精液品質(zhì)。在低溫條件下，由于精子代謝活動(dòng)水平降低，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗減少，會(huì)有效延長(zhǎng)精子的生命周期[6]。但在精液的低溫保存過(guò)程中，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精液活性氧(Reactive oxygen species, ROS)含量偏高，氧化平衡遭到破壞，精子會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷、膜透性失效、蛋白質(zhì)磷酸化等等一系列損害其生命的現(xiàn)象，進(jìn)而影響精液低溫保存效果[7-10]。因此，向低溫稀釋液中添加抗氧化物是必要的舉措。褪黑素(Melatonin, MLT)是一種由松果腺合成和分泌的重要胺類激素，具有抗氧化能力，可保護(hù)細(xì)胞的細(xì)胞膜脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等成分[11]。近年來(lái)已有許多研究中將褪黑素作為抗氧化劑運(yùn)用到動(dòng)物精液體外保存中，如豬精液低溫保存[12]。但褪黑素在羊精液低溫保存中的應(yīng)用尚不多見(jiàn)，且其對(duì)羊精液的低溫保存添加量以及影響效果尚不明確。本試驗(yàn)以不同濃度褪黑素添加到基礎(chǔ)稀釋液中，通過(guò)對(duì)精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性、線粒體活性等指標(biāo)的測(cè)定，進(jìn)行精液品質(zhì)分析，以期為羊精液低溫保存稀釋液配方的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要試驗(yàn)設(shè)備有顯微鏡(南寧松景天倫)、熒光顯微鏡(日本 Nikon)、恒溫加熱板、水浴箱、酶標(biāo)儀(寶特Bio-Tek)、移液器(Sigma公司)、冰箱等。褪黑素、D-果糖、檸檬酸鈉、PVA、EDTA、碳酸酸鈉、葡萄糖、碘化丙啶(PI)、羅丹明123(Rh123)、二甲基亞砜(DMSO)等(均為sigma公司生產(chǎn))；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自上海佳和生物公司、HOST低滲膨脹試劑盒(GMS14017)購(gòu)自Genmed 公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)其分為五組，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。每組低溫保存稀釋液中分別加入褪黑色素0、10、20、40、80 mg/L。用各組低溫保存稀釋液稀釋山羊精液，通過(guò)測(cè)定、分析各組5 d內(nèi)的精子活率、頂體完整性、質(zhì)膜完整性、線粒體活性評(píng)價(jià)不同褪黑色素添加量在山羊精液低溫保存時(shí)的效果，并篩選出褪黑色素的最佳添加量。

1.3 精液樣品的采集

試驗(yàn)所用精液為陜西大荔某牧業(yè)有限公司2～3歲的健康薩?？斯?，用假陰道法采集精液后，并立即進(jìn)行活率檢查，選擇精子活率0.8以上精液放置于36～38 ℃保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室用于試驗(yàn)。

1.4 溶液的配制

羊精液低溫保存基礎(chǔ)稀釋液：葡萄糖 1.15 g, D-果糖 1.45 g, 碳酸氫鈉 0.125 g, 檸檬酸鈉 1.17 g, PVA 0.25 g, EDTA 0.23 g, 青霉素 5 000 IU, 鏈霉素 0.1 g,融于100 mL超純水中。

抗氧化劑添加：在各組稀釋液中分別添加0、10、20、40、80 mg/L的褪黑素， 37 ℃下水浴靜置30 min，待其冷卻后，于4 ℃冰箱保存。

碘化丙啶(PI)貯存液：0.000 2 g PI 溶于10 mL PBS中，0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，-20 ℃避光貯存。

羅丹明123(Rh123)貯存液：0.000 2 g 羅丹明123溶于1 mL DMSO，0.45 μm濾膜過(guò)濾后，避光貯存。

1.5 精液的稀釋

精液采集前1 h，將稀釋劑放置于37 ℃的水浴鍋中。分別用5種含有不同濃度褪黑素的稀釋液(0、10、20、40、80 mg/L)，按照稀釋液與精液 8:1 的比例分次將等溫稀釋液沿容器壁緩慢加入精液中，將精液進(jìn)行稀釋，并分別檢測(cè)稀釋后每組的精子活率。然后再將其裹上16層紗布放入4 ℃冰箱中(梯度降溫)，每12 h應(yīng)翻動(dòng)一次精液；每24 h檢測(cè)其活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率等。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 精子活率 精液搖勻后，取10 μL中層稀釋精液制片，在37 ℃溫度下，做顯微鏡(400×)檢查，用估測(cè)法判定精子活率。

1.6.2 質(zhì)膜完整率 用HOST試驗(yàn)法[13]進(jìn)行精子質(zhì)膜完整率測(cè)定。取20 μL 解凍孵育后的精液樣品，在其中加入等溫HOST 低滲溶液 200 μL 混勻，然后置于37 ℃恒溫水浴鍋中，30 min后，在顯微鏡下觀察精子尾部的彎曲率(每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)不少于200枚精子)。

1.6.3 頂體完整率 采用姬姆薩染色法檢測(cè)[14-15]測(cè)定頂體完整率。分別吸取30 μL試驗(yàn)組精液制片，自然干燥后用5%福爾馬林溶液固定10 min，然后水洗，風(fēng)干，再在姬姆薩液中染色1.5～2 h，洗去浮色，風(fēng)干，在1000×顯微鏡下檢查并計(jì)算頂體完整率(每次不少于200枚精子，重復(fù)5次)。

1.6.4 線粒體活性 取五個(gè)試管，在每個(gè)試管中分別加入PI貯存液1 μL、Rh123貯存液1 μL，避光培養(yǎng)10 min；取等溫基礎(chǔ)稀釋液將各試驗(yàn)組精液稀釋，調(diào)整精子密度至3×106～6×106。吸取50 μL稀釋后的精液，加入上述避光培養(yǎng)的混合液中，37 ℃黑暗潮濕環(huán)境中培養(yǎng)30 min。然后取每組精液10 μL滴在載玻片上，在熒光顯微鏡(400×)下觀察，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)不少于200個(gè)精子，計(jì)算完整線粒體的精子的百分率。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用 Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS22.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行均值的多重比較，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)低溫稀釋保存后的羊精子活率的影響

由表1可知，精液低溫保存0 d時(shí)，各試驗(yàn)組差異不顯著(P> 0.05)，表明精液剛稀釋完時(shí)褪黑素對(duì)精液無(wú)明顯影響。精液低溫保存1 d時(shí)，加入不同濃度的褪黑素均能提高精子活率。而濃度為20 mg/L褪黑素試驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間段的精子活率均最高，且差異顯著(P<0.05)；而濃度80 mg/L褪黑素處理組效果最差，甚至低于沒(méi)有加褪黑素的對(duì)照組。

2.2 褪黑素對(duì)低溫保存后的羊精子質(zhì)膜的影響

本研究中，精液剛稀釋完時(shí)，五組的精子質(zhì)膜完整率無(wú)差異(P>0.05)；從保存的第3天開(kāi)始，20 mg/L的褪黑素試驗(yàn)組，精子質(zhì)膜完整率顯著高于其他各試驗(yàn)組(P<0.05)；在保存期間，10、20、40 mg/L褪黑素均能提高精子質(zhì)膜完整率，而80 mg/L褪黑素小組在保存期間的處理效果均表現(xiàn)最差，顯著低于其他各組(P<0.05)。

2.3 褪黑素對(duì)低溫保存后的羊精子頂體的影響

本研究中，精液保存2 d后，濃度為10和20 mg/L褪黑素試驗(yàn)組的精子頂體完整率顯著高于濃度為40和80 mg/L褪黑素試驗(yàn)組(P<0.05)。精液保存3 d后，濃度為20 mg/L褪黑素處理組的精子頂體完整率均顯著高于其他各組(P<0.05)；而在精液保存期間，濃度為80 mg/L褪黑素試驗(yàn)組的精子頂體完整率顯著低于其他各組(P<0.05)，甚至低于無(wú)褪黑素添加的對(duì)照組。

表1 不同濃度褪黑素對(duì)羊精液低溫保存效果的影響Table 1 Effect of different concentrations of meletonin on conservation effect of sheep sperm at low temperture %

注:同行數(shù)據(jù)后的不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letter in the same row indicate significant difference(P<0.05)，same letter indicate insignificant difference(P>0.05).

2.4 褪黑素對(duì)低溫保存后的羊精子線粒體活性的影響

本研究中，精子線粒體活性隨著褪黑素濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。精液保存1～4 d時(shí)，褪黑素濃度為20 mg/L組線粒體活性均高于其他各組；精液保存5 d時(shí)，褪黑素濃度為20 mg/L的處理組精子線粒體活性高于對(duì)照組，且差異顯著(P<0.05)；褪黑素濃度為80 mg/L的處理組精子線粒體活性顯著低于對(duì)照組。

3 討 論

在正常的生命活動(dòng)中，許多生理功能需要依賴自由基/活性氧(ROS)來(lái)執(zhí)行，因此自由基/活性氧(ROS)的存在必不可少。然而，Parrilla等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)含有過(guò)多ROS時(shí)，它會(huì)攻擊一些重要的生物大分子，導(dǎo)致生物機(jī)體損傷。呂逸清等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ROS與精子凋亡率呈正相關(guān),這是因?yàn)樵谘虻木旱蜏乇４嬷?，ROS的含量會(huì)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，致使精子發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，影響精子的膜結(jié)構(gòu)和功能，使精子線粒體和DNA受到損傷[18]，這些損傷有可能會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，使精子發(fā)生凋亡，進(jìn)而影響精液低溫保存效果。本試驗(yàn)通過(guò)在羊的精液稀釋液中加入不同濃度的抗氧化劑-褪黑素來(lái)研究對(duì)羊精液低溫保存效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羊精液稀釋液中添加適量濃度的褪黑素(20 mg/L)，可維持精子活力，提高精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性以及線粒體活性，從而提高羊精液低溫保存質(zhì)量。提示褪黑素在精液的低溫保存過(guò)程中能夠減少ROS產(chǎn)生，起到保護(hù)精子，延長(zhǎng)精液的低溫保存時(shí)間的效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度褪黑素有利于提高精子保存品質(zhì)和保存時(shí)間，說(shuō)明了添加抗氧化物的必要性。張?zhí)鞂毜萚19]發(fā)現(xiàn)低濃度褪黑素能夠促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，從而延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間。朱銀莉等[20]在豬常溫保存稀釋劑中添加褪黑素，結(jié)果表明褪黑素能夠延長(zhǎng)精子的有效存活時(shí)間。在本試驗(yàn)中，低濃度的褪黑素能夠提高山羊精液低溫保存質(zhì)量的試驗(yàn)結(jié)果和上述研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，添加一定濃度(10 mg/L、20 mg/L、40mg/L)的褪黑素有利于提高精子保存品質(zhì)，能有效增加精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率以及線粒體活性，其中褪黑素濃度為20 mg/L時(shí)效果最好。但隨著添加褪黑素濃度的升高至80 mg/L，精子低溫保存效果下降明顯。

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