王苗苗，張玲玲，張 峣，冉旭華，聞曉波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）為副黏病毒科、呼吸道病毒屬成員，與牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）共同構成了引發(fā)牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病毒性病原，常導致持續(xù)性感染，是目前引發(fā)反芻動物急性呼吸道疾病的主要病原，也是引起世界范圍內(nèi)的舍飼牛發(fā)病及死亡的主要原因之一，對世界養(yǎng)牛業(yè)造成的經(jīng)濟損失較大[1-4]。自1959年Reisinger等首次從犢牛腎臟中分離到BPIV3，之后世界上許多國家也相繼報道分離出BPIV3，目前該病毒已呈現(xiàn)世界性廣泛分布的趨勢[5-10]。我國于2008年由劉鵬等在黑龍江省分離出該病毒[11]，此后在多地也分離到該病毒[3，12]。經(jīng)血清學調(diào)查表明，養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達的地區(qū)感染該病毒情況較重，已在我國廣泛性分布[13]。

BPIV3具有核衣殼結構和囊膜[14]，與仙臺病毒等其他副粘病毒相似。目前為止，已發(fā)現(xiàn)BPIV3有A、B、C 3種基因型[15]。編碼M蛋白、磷蛋白P、F蛋白、N蛋白、NP蛋白、L蛋白及D、V、C 3種非結構蛋白[14，16]。NP蛋白為BPIV3的核衣殼蛋白，保守性較高[16]，因此本研究擬選取NP基因構建融合蛋白表達載體，建立間接ELISA方法來檢測BPIV3抗體水平，為牛副流感3型提供高效便捷的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種、病毒、血清 原核表達質(zhì)粒pET-28a、 菌 株 E.coli BL21（DE3）及 E.coli DH5α、BPIV3c NX49分離株、BPIV3陽性血清及陰性血清、BVDV陽性血清、BHV-I陽性血清均由黑龍江八一農(nóng)墾大學預防實驗室保存。

1.2 主要試劑 TRIzol、Ni-NTA Purification System（ 美 國 Invitrogen）； RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、蛋白質(zhì)Marker、限制性內(nèi)切酶Nde I、BamH I、Sac I、HindⅢ（美國Thermo Fisher Scientific）； Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System、GoTaq? Green Master Mix（美國Promega）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗牛IgG（Sigma）；PrimeSTARTMHS DNA Poymerase及DNA Marker（日本TaKaRa）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 抗原表位區(qū)域的篩選 利用DNASTAR中Protean程序?qū)X49株NP基因進行抗原表位分析，所選區(qū)域命名為 NP-N（8～156 aa）及 NP-C（368～507 aa）并設計2對特異性引物進行擴增，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物序列如表1所示。

表 1 引物序列Table 1 Sequences of primer

1.4 目的基因的擴增及純化 參照TRIzol使用說明書提取BPIV3 RNA，參照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，并以ddH2O為陰性對照，反應體系如下：5×PrimeSTAR?Buffer 10 μL，dNTPs 5 μL，Prime-STAR?HS 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，補加ddH2O至50 μL。PCR反應條件：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃最終延伸10 min，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并通過Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行回收純化。

1.5 重組質(zhì)粒ppEETT--2288aa--NNPP--NN--CC的構建 將NP-N純化產(chǎn)物及載體pET-28a分別經(jīng)NdeI、BamH I雙酶切，回收并純化酶切產(chǎn)物，以T4 DNA連接酶16℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α，于37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種至2 mL含35 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以NP-N-F/R、NP-C-F/R、T7 Promoter/Terminator為引物對重組菌進行鑒定，以ddH2O為陰性對照。通過堿裂解法提取重組菌質(zhì)粒，并以NdeI、BamH I雙酶切做進一步鑒定。將NP-C純化產(chǎn)物與重組質(zhì)粒pET-28a-NP-N分別經(jīng)SacI、HindⅢ雙酶切，以T4 DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化、鑒定方法同上。將鑒定正確的重組菌送往北京六合華大基因科技股份有限公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-NP-N-C。

1.6 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析 將重組質(zhì)粒pET-28a-NP-N-C及空載體pET-28a分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)中，并將重組菌1%轉(zhuǎn)接至含有35 μg/mL的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度為1 mM的IPTG，誘導4 h，收集菌體并以PBS洗滌，Bug Baster?Master Mix裂解菌體，分別收集裂解后上清及沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達形式。

1.7 重組蛋白的純化及鑒定 收集2 L誘導表達后的重組菌，超聲裂解菌體，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)中收集裂解沉淀，采用Ni-NTA Purification System純化重組蛋白，具體方法參照說明書，對純化后的目的蛋白進行復性處理。重組蛋白以SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜并以脫脂乳封閉，加入BPIV3陽性血清（1:80倍稀釋），4℃孵育過夜。加入HRP標記的兔抗牛IgG（1:5 000倍稀釋），37℃孵育1 h。加入DAB顯色3 min，以ddH2O終止反應。

1.8 間接EELLIISSAA方法的優(yōu)化 將融合蛋白NP-N-C以CBS倍比稀釋至0.5～8 μg/mL，包被ELISA板，100 μL/孔。對BPIV3陰、陽性血清也分別倍比稀釋至1:40～1:320，采用棋盤滴定試驗，確定最佳抗原包被濃度及血清最佳稀釋度。設置4℃包被過夜，37℃包被1 h，37℃包被2 h，37℃包被1 h后4℃過夜，共4組不同的包被條件，確定抗原最佳包被條件。分別以2.5%、5%、10%3個濃度脫脂乳作為封閉液，37℃封閉，封閉時間設置為30、60、90和120 min，對封閉液最佳濃度及時間進行優(yōu)化。分別以1:3 000、1:5 000、1:7 000 3個不同的稀釋度對HRP標記的兔抗牛IgG進行稀釋，37℃孵育，孵育時間設置為30、45和60 min，對二抗最佳稀釋倍數(shù)及孵育時間進行優(yōu)化。以TMB顯色液顯色，顯色時間分別設置為5、10、15和20 min，對顯色時間進行優(yōu)化。測定陽性血清、陰性血清的OD450并計算P/N值，以P/N值最大且陽性血清OD450≥1.0、陰性血清OD450＜0.2作為間接ELISA優(yōu)化條件的判定標準。

1.9 陰、陽性臨界值的確立 隨機選取85份BPIV3陽性血清及79份BPIV3陰性血清，以已建立的ELISA方法分別進行檢測，測定OD450值。將測得的OD450值進行統(tǒng)計學分析。通過非參數(shù)法構建ROC曲線，以Youden指數(shù)最大的切點作為陰陽性判斷的臨界點，并確定該方法的特異性及敏感性。

1.10 重復性試驗 取一塊同批次包被的酶標板，用其檢測4份不同效價的陽性血清和2份陰性血清，每份血清做3個平行重復，以ELISA方法篩選出的最優(yōu)條件來對稀釋后血清進行檢測，統(tǒng)計學分析OD450并計算批內(nèi)重復試驗變異系數(shù)，統(tǒng)計學分析試驗結果。

用不同時間抗原包被的ELISA板，對4份不同效價的陽性血清和2份陰性血清進行3次批間重復檢測，以ELISA篩選出的最優(yōu)條件來對稀釋后血清進行檢測，統(tǒng)計學分析OD450并計算批間重復試驗變異系數(shù)，評價該方法的批間重復性。

2 結果

2.1 目的基因NNPP--NN及NNPP--CC的擴增 PCR擴增目的基因NP-N及NP-C，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到447 bp及420 bp 2條特異性條帶，與預期片段大小（如圖1）。

2.2 原核表達重組質(zhì)粒的鑒定 菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增出片段大小為447 bp（NPN）、420 bp（NP-C）、1 146 bp（NP-N-C）的特異性條帶，與預期相符（如圖2）。測序結果表明，重組質(zhì)粒中的目的基因與NX49株基因組序列素編碼的核苷酸、氨基酸的同源性均為100%，可用于原核表達。

2.3 重組蛋白的誘導表達形式的鑒定 誘導表達產(chǎn)物裂解后上清及沉淀經(jīng)Glycine-SDS-PAGE分析，得到大小為42 kDa的條帶，與預期大小相符（如圖3），并以包涵體的形式表達。同時于約35 kDa處出現(xiàn)一條帶，需進一步鑒定。

2.4 重組蛋白的純化 重組蛋白經(jīng)Ni-NTA系統(tǒng)純化后于42 kDa及35 kDa位置均出現(xiàn)條帶(如圖4)。純化的重組蛋白濃度約為123 μg/mL。

2.5 重組蛋白的Western BBlloott鑒定 以BPIV3 NX49株為陽性對照，Western Blot結果表明重組蛋白在42 kDa及35 kDa處條帶均能與BPIV3陽性血清發(fā)生特異性反應，全病毒蛋白對照組也在42 kDa及35 kDa位置處出現(xiàn)了2條特異性條帶（如圖5），說明表達的目的蛋白以2種形式存在，而且均具有良好的反應活性。

圖 1 NP基因片段的RT-PCR擴增Fig.1 Amplifiation ofNPfragment by PCR

圖 2 目的基因的擴增Fig.2 Amplifiation of target genes

M：蛋白Marker；1：對照組誘導后裂解上清；2：對照組誘導后裂解沉淀；3：重組菌誘導后裂解上清；4：重組菌誘導后裂解沉淀

圖 4 純化后重組蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析Fig.4 The Glycine-SDS-PAGE of purified recombinant protein

2.6 間接EELLSSIIAA方法反應條件的優(yōu)化結果 對BPIV3間接ELISA反應條件的優(yōu)化結果見表2。

2.7 間接EELLIISSAA臨界值的確定 通過對隨機選取的85份BPIV3陽性血清及79份BPIV3陰性血清檢測，統(tǒng)計學分析OD450值，得到特異性與敏感性相關的ROC曲線（如圖6），本研究中Youden指數(shù)最大為0.927，所對應的臨界值為0.267，此時該方法的特異性為97.4%，靈敏性為95.3%。

M：蛋白質(zhì)；1：對照組誘導后裂解沉淀與BPIV3陽性血清的反應；2：重組蛋白與BPIV3陽性血清的反應；3：NX49株與BPIV3陽性血清的反應

2.8 重復性試驗 通過對4份陽性血清及2份陰性血清進行的同批次及不同批次的重復性試驗，分析統(tǒng)計試驗結果，結果見表3，分別計算OD450平均值、標準差、變異系數(shù)，結果顯示批內(nèi)批間重復性試驗變異系數(shù)均小于10%，證明了該間接ELISA方法重復性較好。

圖 6 ROC曲線Fig.6 Receiver-operator characteristic curve

表 2 間接ELISA方法反應條件的優(yōu)化Table 2 The optimized coditions of indirect ELISA

表 3 重復性試驗結果Table 3 The result of repeatability test

2.9 臨床樣品的檢測 對279份來自不同地區(qū)的血清采用本試驗建立的間接ELSIA方法進行檢測，檢出BPIV3陽性血清223份，陰性血清56份，血清BPIV3抗體陽性率為79.9%，如表4所示。

表 4 BPIV3抗體血清學調(diào)查Table 4 Serological survey of antibodies against BPIV3 in 3 provinces of China

3 討論

BPIV3等病毒引起的BRDC發(fā)病率較高，常與其他病原體混合感染或繼發(fā)感染，臨床診斷較難，危害舍飼牛的健康，嚴重影響?zhàn)B牛業(yè)的經(jīng)濟效益，而我國針對BPIV3的檢測方法的研究尚不成熟，尚無商品化的檢測試劑盒[17-19]。在養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)達國家，BPIV3的感染率及抗體陽性率同樣處于較高水平。有研究指出20世紀80年代，墨西哥及阿根廷的BPIV3陽性率分別為85.6%和77.3%，歐美的健康牛血清中BPIV3普遍存在抗體[20-21]。澳洲僅出口牛中BPIV3的感染率及抗體陽性率達到了46%和87%[22]。國內(nèi)也進行了一些BPIV3感染的流行病學調(diào)查，我國BPIV3血清陽性抗體率高達77.96%，感染率與抗體陽性率在逐漸增加[23]。因此建立針對BPIV3的診斷技術對BPIV3防控至關重要。

ELISA方法具有檢測快速、操作便捷等特點，適用于流行病學調(diào)查及牛場大規(guī)模檢測時的血清檢測。傳統(tǒng)的間接ELISA檢測方法一般以全病毒或病毒的某個蛋白作為包被抗原，全病毒抗原難以純化且成本較高。本研究選取NP基因中的抗原表位區(qū)域構建了pET-28a-NP-N-C原核表達載體，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)中，以純化的重組蛋白作為抗原與待檢BPIV3抗體相結合，建立的間接ELISA方法重復性好、特異性強和敏感性高，可用于BPIV3抗體的檢測，為BPIV3檢測試劑盒的開發(fā)鋪設了條件。

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