孔德福

（東南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，江蘇南京210000）

0 引言

自從1996年Kasianowicz[1]用電壓驅(qū)動(dòng)的方式實(shí)現(xiàn)了α-血溶素通過生物孔，用納米孔作為傳感器分析DNA的序列已經(jīng)成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域。

納米孔DNA測(cè)序方法原理是當(dāng)DNA分子通過納米孔的時(shí)候，會(huì)造成納米孔的局部堵塞，從而實(shí)現(xiàn)過孔離子電流的變化，通過離子電流的變化得到過孔DNA序列的信息。但為了克服DNA的熵阻，要想驅(qū)動(dòng)DNA就必須施加較大的電流，從而會(huì)導(dǎo)致DNA的過孔速度過快，使得DNA過孔的時(shí)間和空間分辨率降低，噪音增大。所以，降低DNA過孔速度是實(shí)現(xiàn)納米孔測(cè)定DNA序列的關(guān)鍵技術(shù)。將DNA綁到有孔小珠或磁珠上，通過光鑷或磁鑷控制小珠，能夠?qū)崿F(xiàn)DNA的降速；利用AFM或其他的納米級(jí)控制，也能夠達(dá)到降低DNA速率的效果。

本文探究了在磁珠綁定下DNA過孔電流和綁定斷裂的情況，在不同的電壓下得到了明顯的特征信號(hào)，據(jù)此研究了DNA和磁珠過孔的規(guī)律性。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

納米孔的加工是采用FIB在氮化硅薄膜上穿孔的方法[2]。納米孔的SEM圖像和純緩沖液下的離子電流如圖1（a）和圖1（b）所示。試驗(yàn)中使用食人魚進(jìn)行納米孔的清洗，使用等離子清洗機(jī)進(jìn)行親水處理。

圖1 納米孔性能表征

磁珠基體為聚苯乙烯，外部修飾鏈霉親和素。實(shí)驗(yàn)所用的DNA為λDNA，引物序列為P-5-GGGCGGCGACCTT-3-B，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)將引物修飾到DNA上，采用苯酚氯仿法提純DNA。離心后，留底部沉淀磁珠，重復(fù)三遍，去掉原磁珠脫落的鏈霉親和素及其他修飾物。加入DNA，將兩者混合，輕搖振動(dòng)，靜置30 min，使綁定反應(yīng)發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)原理圖如圖2所示，采用左右液池，離子電極采用Ag/AgCl電極，連接兩個(gè)電極浸在緩沖液中，CIS和TRANS液池之間唯一的聯(lián)系就是納米孔。緩沖液用的是1.0 mol/L的KCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為8。離子電流的采集使用Axon公司的膜片鉗放大器，其他裝置全部放在法拉第籠中。

圖2 工作原理圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在充分的混合、靜置下，DNA與鏈霉親和素結(jié)合，在電壓驅(qū)動(dòng)下，DNA能夠穿過納米孔，而磁珠無法穿過。開始階段，DNA與磁珠通過布朗運(yùn)動(dòng)隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，當(dāng)進(jìn)入電場(chǎng)捕獲區(qū)域時(shí)，DNA加速向納米孔運(yùn)動(dòng)，使得過孔事件發(fā)生。DNA與磁珠具有不同的運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)，所以會(huì)導(dǎo)致綁定的DNA斷裂，成為游離態(tài)的DNA通過納米孔。每個(gè)過孔事件均具有相同的四個(gè)階段：（1）進(jìn)入階段，電流急劇下降，DNA已經(jīng)進(jìn)入納米孔；（2）彈性階段，由于磁珠相對(duì)于DNA來說，其速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于DNA的運(yùn)動(dòng)速度，所以在DNA進(jìn)入納米孔之后，與磁珠之間必定產(chǎn)生斷裂，鏈霉親和素-生物素之間的鏈接可以等效成彈性鏈接，在等效“彈簧”到達(dá)斷裂臨界點(diǎn)之前會(huì)有一個(gè)伸長(zhǎng)過程，這個(gè)過程將導(dǎo)致DNA在納米孔中的停留時(shí)間增加，時(shí)間分辨率提高；（3）在到達(dá)彈性臨界點(diǎn)之后，隨即進(jìn)入斷裂階段；（4）DNA通過納米孔，最后電流開始恢復(fù)。

圖3所示為不同電壓下過孔事件的個(gè)數(shù)。

圖3 不同電壓下過孔事件個(gè)數(shù)

實(shí)驗(yàn)表明，隨著電壓的增大（100～700 mV），其他條件相同的情況下（緩沖液濃度均為1.0 mol/L，pH=8.0，溫度為室溫），過孔事件發(fā)生次數(shù)隨著電壓的增加而增加，呈現(xiàn)一定的線性趨勢(shì)，說明隨著電壓的增加，DNA通過納米孔的捕獲效率增加。該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以用公式（1）[3]進(jìn)行解釋：

式中，r*為電壓捕獲區(qū)域半徑（與納米孔的距離）；d為納米孔直徑；μ為DNA電泳遷移率；l為納米孔長(zhǎng)度；D為DNA的擴(kuò)散系數(shù)；ΔV為偏置電壓。

進(jìn)而推出捕獲率與偏置電壓之間的關(guān)系，如公式（2）所示[3]：

由此可以看出，DNA的捕獲率與偏置電壓呈現(xiàn)線性關(guān)系。而磁珠綁定的DNA與之類似，當(dāng)綁定著許多DNA的磁珠通過布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)入捕獲區(qū)域時(shí)，DNA在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下開始向納米孔運(yùn)動(dòng)，并最終通過納米孔。

3 結(jié)語

本文研究了DNA與鏈霉親和素修飾的磁珠綁定的情況，結(jié)果表明，DNA與磁珠實(shí)現(xiàn)了綁定，且隨著電壓的增大，磁珠綁定的DNA的捕獲率增大。

[1]KASIANOWICZ J J，BRANDIN E，BRANTON D.Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996(24):13770-13773.

[2]馬建，王欣，李堃，等.基于氮化硅薄膜納米孔制備及DNA分子檢測(cè)[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，47（2）：265-270.

[3]WANUNU M，MORRISON W，RABIN Y，et al.Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient[J].Nature Nanotechnology，2010，5(2)：160-165.