張玲玉，李思琦，吳 東，陳浩佳，王麗京，鄭凌云△

(廣東藥科大學(xué)：1.基礎(chǔ)學(xué)院；2.公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 510006)

高血壓是引發(fā)心血管疾病的主要危險因素之一，每年世界范圍內(nèi)因此死亡人數(shù)高達940萬[1]。近年來研究顯示，含糖甜味劑飲料攝入過多可導(dǎo)致高血壓、肥胖及糖尿病等慢性疾病[2-3]。而蔗糖中的果糖及含糖甜味劑飲料中的高果糖漿被認為是引發(fā)上述相關(guān)疾病的主要因素[4-5]。部分動物實驗已證實，飲食中的果糖可刺激鈉和氯在小腸的重吸收而降低腎臟對鹽的排泄從而導(dǎo)致鹽過量而升高血壓[6-9]。但到目前為止，對于果糖引起血壓升高及血管重構(gòu)的病理改變的機制還不十分清楚。因此，本研究目的旨在探討低鹽飲食是否能改善高果糖對血管重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1動物來源 Wistar大鼠42只(雄性)，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，無特殊病原體(SPF)級，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2主要設(shè)備和試劑 石蠟切片機(Leica，德國)；全自動石蠟包埋機 (湖北亞光)；全自動生物組織脫水機(TS-12N，湖北孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)；大鼠無創(chuàng)鼠尾血壓測定儀(AD instruments，澳大利亞)；光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；彈性纖維染色(EVG染色)試劑盒(珠海貝索生物公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；天狼星紅染色試劑盒(Sigma，美國)；果糖(AMRESCO，美國)；螺內(nèi)酯 (每片12 mg，北京中新制藥廠)；APES(北京中杉金橋)；兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，武漢博士德生物公司)；兔抗大鼠纖維連接蛋白(FN,CST，美國)；羊抗兔二抗(武漢博士德生物公司)；DAB顯色劑(賽默飛世爾科技公司)。

1.3方法

1.3.1動物模型構(gòu)建 將大鼠隨機分為6組，每組7只：(1)對照組給予常規(guī)標準大鼠飼料(含0.5% NaCl，w/w)及蒸餾水8周；(2)高鹽組(HNa組)給予7%高鹽飼料(含7% NaCl，w/w)及正常的蒸餾水；(3)高果糖組(HF組)按10%果糖水(w/v)作為飲用水，飼料同對照組；(4)高果糖聯(lián)合高鹽組(HFNa組)給予7%高鹽飼料及10%果糖水(w/v)作為飲用水；(5)高果糖聯(lián)合低鹽組(HFLNa組)給予0.07%低鹽飼料(含0.07%NaCl，w/w)及10%果糖水(w/v)作為飲用水；(6)高果糖聯(lián)合螺內(nèi)酯組(HFE組)同高果糖組，并在第4周開始給予螺內(nèi)酯(HFE，50 mg·kg-1·d-1，管飼法)，連續(xù)4周。

1.3.2大鼠動脈血壓測定 用Powerlab血壓儀測量大鼠尾根部血壓。實驗大鼠在正式實驗前需至少進行3次血壓測量訓(xùn)練，正式實驗時分別在喂食不同飲食前1 d及喂食8周后測量記錄大鼠血壓值。

1.3.3血管壁組織學(xué)染色 大鼠經(jīng)灌注固定后，收集各組血管，心臟組織，4%多聚甲醛固定過夜；脫水，浸蠟，包埋后，制備4 μm組織切片。常規(guī)脫蠟入水，按HE、EVG試劑盒說明書進行操作。

1.3.4血管壁組織免疫組化染色 取各組大鼠血管組織石蠟切片，脫蠟浸濕后，高壓修復(fù)，室溫用10%牛血清清蛋白(BSA)封閉切片2 h，于切片上滴加兔抗大鼠抗體(1∶100)濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBST洗滌兩次后，滴加羊抗兔二抗(1∶200)室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后顯微鏡下顯色觀察，直至出現(xiàn)棕黃色顆粒后即終止顯色，脫水，透明后封片拍照。

2 結(jié) 果

2.1高鹽飲食或高果糖水對大鼠動脈血壓的影響 HF組血壓(133.94±5.86)mm Hg、HNa組(128.09±7.56)mm Hg較對照組(111.03±9.17)mm Hg顯著升高(P<0.05)，HFNa組血壓(140.97±9.75)mm Hg較HF組進一步升高(P<0.05)；而HFLNa組(106.04±9.59)mm Hg及HFE組(103.99±7.12)mm Hg較HF組mm Hg降低(P<0.05)。

圖1 血管壁組織學(xué)分析結(jié)果(HE,×40)

圖2 血管壁α-SMA的表達變化(免疫組化×40)

圖3 血管壁細胞外基質(zhì)纖連蛋白表達變化(免疫組化，×40)

圖4 血管壁彈力纖維結(jié)構(gòu)變化(EVG，×40)

2.2血管壁HE染色 與對照組和HNa組相比，高果糖水可明顯引起血管壁增厚(P<0.01)；而HNa組與對照組相比，管壁厚度未見明顯差異(P>0.05)。進一步分析可見高果糖聯(lián)合高血也可使得血管壁增厚(P<0.01)，但與HF組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。給予低鹽飲食和HFE后均可顯著改善高果糖誘導(dǎo)的血管壁增厚(P<0.01)。見圖1。

2.3血管壁α-SMA免疫組化結(jié)果 HNa組陽性表達面積(0.006 1±0.000 3)或HF組陽性表達面積(0.006 3±0.000 2)較對照組陽性表達面積(0.004 6±0.000 3)明顯增多(P<0.05)。而HFNa組陽性表達面積(0.008 6±0.000 3)較HF組陽性面積明顯增多(P<0.05)。而HFLNa組(0.006 8±0.000 2)和HFE組(0.004 2±0.000 4)與HF組相比，可有效逆轉(zhuǎn)血管壁平滑肌增生(P<0.05)。見圖2。

2.4細胞外基質(zhì)纖連蛋白免疫組化染色結(jié)果 與對照組相比(0.001 3±0.000 1)，HNa組(0.002 6±0.000 2)和HF組(0.004 7±0.000 2)纖連蛋白表達均升高(P<0.001)，且HF組和HNa組比較，高果糖促進纖連蛋白表達的作用比高鹽的作用更明顯(P<0.001)。見圖3。

2.5血管壁彈力纖維EVG染色結(jié)果 HNa組可刺激彈力纖維增粗而HF組可刺激內(nèi)膜下彈力纖維增生，而HNa組合并HF組可進一步刺激彈力纖維層數(shù)增加，低鹽飲食只能部分改善彈力纖維增生的變化，相比而言，HFE則可以更好地逆轉(zhuǎn)高果糖引起的彈力纖維增生。見圖4。

3 討 論

研究已證實，高果糖飲食可促進肝臟脂肪合成并誘發(fā)胰島素抵抗[10]。胰島素抵抗又可通過增加腎臟對鈉鹽重吸收促進高血壓形成。CATENA等[11]的研究顯示，給予高果糖飲食同時增加高鹽(7.5%)飲食或正常鹽(0.5%)飲食均可引起收縮壓顯著升高，低鹽飲食(0.07%)則不會刺激血壓升高。而本研究發(fā)現(xiàn)，利用醛固酮受體阻斷劑HFE可有效降低高果糖引起的血壓升高。HFE本身可通過阻止腎遠曲小管上皮細胞對鈉離子的重吸收而達到促尿鈉排泄和阻止水分重吸收的目的。且筆者前期研究結(jié)果顯示，HFE還可明顯改善高果糖引起的腎損傷[12]。因此，進一步提示高果糖飲食與刺激鈉鹽重吸收有關(guān)。

有研究還顯示，單純高鹽可通過降低腎組織中胰島素受體表達而減少胰島素本身對尿鈉排泄的抑制作用，可能部分地解釋了HNa組引起血壓的升高值不及單純高果糖飲食(HF組)的原因。而另一方面，高果糖對鈉鹽潴留有促進作用，且因伴隨胰島素抵抗，增加了腎臟對鈉的重吸收而加重高血壓形成。另外本研究結(jié)果還顯示，給予高鹽飼料合并高果糖水則可進一步升高血壓，提示高鹽和高果糖引起的血壓升高機制可能并不完全一致。

血管重構(gòu)是指在生理如妊娠、衰老或病理如高血壓、動脈粥樣硬化等狀態(tài)下血管壁通過改變其結(jié)構(gòu)以滿足正常的組織血流供應(yīng)[13]。而血管重構(gòu)涉及至少4個細胞過程：血管平滑肌細胞增殖，細胞死亡，細胞遷移及細胞外基質(zhì)合成或降解。血管重構(gòu)發(fā)生依賴于血流動力學(xué)、局部生長因子及縮血管活性物質(zhì)等多方面因素共同作用于血管壁而產(chǎn)生[14]。本研究結(jié)果顯示，高鹽雖然引起血壓明顯升高但血管壁厚度與對照組相比并無顯著差別，但細胞外基質(zhì)沉積明顯增多，EVG染色顯示彈力纖維較對照組有增粗的改變。研究證實血管壁內(nèi)彈力纖維和細胞外基質(zhì)可促使血管壁硬化，進而可引起動脈血壓升高，特別是收縮壓，因此這也部分解釋了HNa組引起血壓升高的原因。進一步分析HF組血管壁結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，高果糖可明顯促進血管壁中層平滑肌細胞增生。與對照組和HNa組相比，管壁明顯增厚，血管平滑肌α-SMA染色和細胞外基質(zhì)染色增強，彈力纖維與對照組和HNa組相比，內(nèi)膜下彈力纖維增多增粗。以上的結(jié)果表明，雖然HNa組和HF組均出現(xiàn)促使血壓升高，但兩組大鼠的血管壁結(jié)構(gòu)的病理改變卻有明顯差異。因此提示高鹽和高果糖對血管壁結(jié)構(gòu)的影響不完全是由于血壓升高所引起。

HFNa組大鼠的血管壁較HF組進一步增厚，且中層血管平滑肌增生明顯，EVG染色顯示彈力纖維增粗且層數(shù)增加，更說明高果糖與高鹽對血管重構(gòu)的作用機制不完全相同。而給予低鹽飲食卻能有效逆轉(zhuǎn)由于單純高果糖引發(fā)的血管重構(gòu)。進一步分析與HFE組的比較發(fā)現(xiàn)，低鹽飲食與HFE相似的效果是均可抑制細胞外基質(zhì)沉積。但低鹽飲食并不能有效減少血管壁中層平滑肌增殖和彈力纖維的變化，而HFE則可抑制高果糖引起的血管平滑肌增生和彈力纖維的改變，提示高果糖引起的血管重構(gòu)不僅與促進鹽的吸收導(dǎo)致水鈉潴留有關(guān)，而且可能還與激活腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)有關(guān)。

研究顯示，高果糖飲食可引起代謝綜合征，表現(xiàn)為大鼠動脈血壓升高，胰島素抵抗，血漿三酰甘油水平升高，高密度脂蛋白水平降低及炎癥因子表達升高[15]。且研究結(jié)果還顯示，給予高果糖飲食1周后主動脈內(nèi)氧化應(yīng)激水平即開始上升[16]。超氧陰離子通過與血管內(nèi)皮釋放的NO生成硝基過氧化物而減少NO的生物可利用率，加速血管內(nèi)皮損傷和刺激血管平滑肌增殖[17-18]，改變內(nèi)皮細胞功能[19]、激活縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮素-1釋放[20]；還可刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)進而加速胰島素抵抗及高血壓形成[21]。此外，高果糖飲食可造成血管炎癥，增加黏附分子表達刺激單核和巨噬細胞在血管壁沉積，從而引起血管壁損傷，刺激細胞外基質(zhì)沉積[22]。

本研究顯示，高果糖可引起顯著的血管重構(gòu)，其特征以中層血管平滑肌增殖及細胞外基質(zhì)沉積為主。這與以往研究所顯示的高果糖引起血管壁低水平慢性炎癥及血管內(nèi)皮損傷等因素有密切關(guān)系。但HFE對血管重構(gòu)的減輕作用也說明高果糖飲食對血管的損傷可能部分通過阻斷血管壁內(nèi)醛固酮受體。有研究已證實，醛固酮可促進血管重構(gòu)和內(nèi)皮功能損傷[23]。且有研究也顯示，高鹽對血管的損傷與激活醛固酮受體有密切關(guān)系[24]。盡管本研究初步證實，低鹽可有效逆轉(zhuǎn)高果糖引起的血壓升高與血管重構(gòu)，但究竟低鹽通過上述何種途徑改善血管重構(gòu)目前還少有明確的相關(guān)報道，很可能與調(diào)控腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性及降低血管炎癥病變有關(guān)。因此，將進一步研究HFLNa組的血管組織中參與血管重構(gòu)的各炎癥因子和信號分子的表達變化及血管壁功能，以期找到低鹽改善高果糖引起血管重構(gòu)的分子機制，并在體外細胞水平進行驗證。

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