姚梓平，秦慧娟，何春輝

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，烏魯木齊 830054)

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的常見形式，該病的病理學(xué)特點(diǎn)表現(xiàn)為肺泡上皮損傷和增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)沉積和瘢痕形成[1]。我國(guó)IPF患者人數(shù)為50萬左右，患病人數(shù)還在持續(xù)增加。該病的治療效果不好，預(yù)后差，5年生存率只有30%～50%。目前IPF的發(fā)病機(jī)制尚不明確。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與多種類型的肺纖維化(PF)有關(guān)[2]。巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生趨化因子CCL2和CCL12，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)和纖維化的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)，間質(zhì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥或促纖維化細(xì)胞因子在IPF患者的肺中升高[3]，說明巨噬細(xì)胞在IPF的發(fā)病機(jī)制中可能起到一定的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，博萊霉素常用于誘導(dǎo)肺損傷和纖維化來模擬研究IPF[4]。葉酸受體(FR)歸為糖基磷脂酰肌醇錨定糖蛋白家族，其對(duì)葉酸和5-甲基四氫葉酸具有高親和力，由于FRα在癌細(xì)胞中的高表達(dá)和FRβ在活化的巨噬細(xì)胞中的高表達(dá)，葉酸受體靶向藥物常應(yīng)用于癌癥和自身免疫疾病的診斷和治療[5]。

為了研究巨噬細(xì)胞中FRβ的表達(dá)在IPF發(fā)病中的作用機(jī)制，檢測(cè)了其在常規(guī)特發(fā)性肺纖維化(UIP)患者和博萊霉素誘導(dǎo)PF的小鼠中肺組織內(nèi)的分布，并且求證減少巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)是否可以抑制博萊霉素誘導(dǎo)小鼠的肺纖維化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1患者肺組織標(biāo)本與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 UIP患者的肺組織從新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的7例UIP患者的肺部中獲得，UIP患者的診斷參照美國(guó)胸科學(xué)會(huì)關(guān)于IPF標(biāo)準(zhǔn)診斷[6]。對(duì)照的肺組織從5例肺癌的切除手術(shù)中獲得。所有患者均簽署知情同意書，此項(xiàng)研究也獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。選取18只健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，平均(19.32±2.30)g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物合格證號(hào)編號(hào)：XJYKDX-20160317001)。

1.2主要試劑與儀器 博萊霉素(Nihon Kayaku Co，日本)，小鼠抗人FRβ單克隆抗體(mAb)(Serotec，英國(guó))，大鼠抗小鼠FRβmAb(克隆5)(Serotec，英國(guó)),抗原修復(fù)液(博士德生物，中國(guó))，小鼠抗人CD68mAb(Dako Japan Co.Kyo，日本)，大鼠抗小鼠CD68mAb(Serotec，英國(guó))，兔抗小鼠TGF-β1抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，山羊抗小鼠CCL2抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，山羊抗小鼠CCL12抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，山羊抗小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體(R&D Systems，美國(guó))，dsFv抗FRβ-PE38(免疫毒素)(博士德生物，中國(guó))，VH-PE38(博士德生物，中國(guó))，MAX-PO二抗(博士德生物，中國(guó))，NovaRED試劑盒(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))。CCD照相機(jī)(Nikon，日本)，計(jì)算機(jī)輔助圖像分析儀(Nikon，日本)。

1.3方法 將小鼠分為正常組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各6只，小鼠中的PF誘導(dǎo)參考GHARAEE-KERMANI等[7]的實(shí)驗(yàn)方法,使用異氟烷對(duì)6～8周齡的雄性C57BL/6J小鼠進(jìn)行麻醉，然后將100 mL溶于鹽水中的博來霉素(4 U/kg)滴入小鼠的氣管。博來霉素滴注第3天，經(jīng)鼻給予小鼠dsFv抗FRβ-PE38(免疫毒素)(實(shí)驗(yàn)組)或VH-PE38(對(duì)照蛋白)(對(duì)照組)。每只小鼠每隔1 d給予濃度為0.1 mg/mL的免疫毒素或?qū)φ盏鞍?0 μL，直到博來霉素滴注后第19天，并持續(xù)監(jiān)測(cè)21 d。在第21天，依然存活的小鼠被處死。正常組的小鼠不做任何處理。小鼠的左肺用于組織學(xué)分析，右肺用于羥脯氨酸分析。所有動(dòng)物程序均符合本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理準(zhǔn)則，并經(jīng)本院委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3.1肺部纖維化評(píng)分 將小鼠左肺進(jìn)行冰凍，切片，冷丙酮固定處理，然后依循Masson三色法步驟染色。每只小鼠制備至少4個(gè)切片，每個(gè)切片中隨機(jī)選擇20個(gè)區(qū)域，遵循盲法原則，由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家閱片評(píng)定。根據(jù)Ashcroft法對(duì)肺纖維化程度進(jìn)行評(píng)分[8]。

1.3.2肺部羥脯氨酸分析 將小鼠右肺經(jīng)空氣干燥、稱重后，在110 ℃條件下，將其置于6 mol/L的HCl溶液中進(jìn)行酸水解，時(shí)間為16 h。將水解產(chǎn)物懸浮在等量的6 mol/L NaOH中，然后過濾，測(cè)定羥脯氨酸的濃度。

1.3.3免疫組化染色 經(jīng)過甲醛固定、石蠟包埋、脫蠟及再水化過程，制備得到人肺組織切片(5 μm)。根據(jù)廠家的說明書，使用區(qū)分自然感染動(dòng)物和接種免疫動(dòng)物(DIVA)的試劑對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)。在用3%脫脂乳和10%正常山羊血清封閉抗原后，再利用鼠抗人CD68單抗，或鼠抗人FRβ單抗，或同型匹配但并不相關(guān)的單抗對(duì)切片進(jìn)行免疫染色。然后用MAX-PO二抗和NovaRED試劑盒進(jìn)一步染色處理。使用0.3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。最后經(jīng)數(shù)字視像CCD照相機(jī)拍攝和計(jì)算機(jī)輔助圖像分析儀分析后，獲得圖像。

利用鼠抗CD68、鼠抗FRβ、抗TGF-β1、抗TNF-α、CCL2、CCL12或同型匹配的無關(guān)抗體，對(duì)經(jīng)博來霉素滴注處理或未處理小鼠的肺組織所制備的丙酮冰凍切片進(jìn)行染色。然后速行雙色免疫組化染色。切片用一代mAb染色后，繼而用NovaRED顯色。將切片置入0.1 mol/L的Gly-HCl緩沖液孵育1 min后，以此洗脫一抗，然后使用TBST(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.15 mol/L NaCl，0.1% Tween-20)洗滌。隨后，依次先將切片與另一原代mAb孵育1 h，然后與生物素化的二抗(Nichirei)孵育30 min，最后與堿性磷酸酶綴合的鏈霉親和素(Nichirei)孵育。二抗染色后利用Vector Blue顯色處理。每塊肺組織選取4個(gè)切片，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析儀對(duì)每個(gè)切片進(jìn)行半定量分析。每個(gè)切片隨機(jī)選定10個(gè)區(qū)域進(jìn)行觀察分析。通過取樣界定免疫染色的顏色閾值，以此檢測(cè)區(qū)分紅色和藍(lán)色，并將該閾值應(yīng)用于所有的樣本。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 繪制Kaplan-Meier曲線，并進(jìn)行廣義Wilcoxon檢驗(yàn)，以此評(píng)估生存率的顯著性。方差分析(ANOVA)用于檢驗(yàn)組間其他數(shù)據(jù)的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)在UPF患者和博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠肺組織中的分布 檢測(cè)UPF患者肺組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)正常肺組織有更多能夠表達(dá)FRβ的間質(zhì)巨噬細(xì)胞(圖1)。博來霉素氣管內(nèi)滴注后3 d的小鼠肺部可見表達(dá)FRβ的肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞，而在14 d后兩種細(xì)胞數(shù)量達(dá)到頂峰(圖2)。在博來霉素滴注后的每個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)，都可以看到巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)主要集中于肺的纖維化病灶處。

A：正常肺組織表達(dá)CD68巨噬細(xì)胞;B：UIP患者肺組織表達(dá)CD68巨噬細(xì)胞;C:正常肺組織表達(dá)FRβ的巨噬細(xì)胞;D:UIP患者肺組織表達(dá)FRβ的巨噬細(xì)胞

圖1巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)在UPF患者肺部的分布情況(×200)

2.2TGF-β1在巨噬細(xì)胞FRβ表達(dá)中的表達(dá) 采用博萊霉素滴注后第7天的小鼠肺部切片來檢測(cè)巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)是否會(huì)釋放TGF-β1，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)都屬于表達(dá)CD68的巨噬細(xì)胞，許多巨噬細(xì)胞中表達(dá)CD68或FRβ的同時(shí)也能表達(dá)TGF-β1，TGF-β1的表達(dá)比例在巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)中顯著高于CD68的巨噬細(xì)胞表達(dá)(圖3)。TGF-β1表達(dá)多聚集于博來霉素誘導(dǎo)形成PF的小鼠肺組織的巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)中。

圖2博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠肺部巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)隨時(shí)間的變化(×200)

2.3免疫毒素作用于 FRβ時(shí)對(duì)博來霉素誘導(dǎo)形成PF病理過程的干預(yù) 滴注博來霉素的第3天到第19天，通過小鼠鼻內(nèi)途徑給予免疫毒素，與給予蛋白的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的免疫毒素能明顯增加小鼠的存活率(P=0.003)(圖4)，同時(shí)也能降低小鼠肺組織的纖維化程度(P=0.014)；實(shí)驗(yàn)組肺組織巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)也減少(P=0.000)，實(shí)驗(yàn)組肺組織羥脯氨酸的整體水平顯著低于對(duì)照組(P=0.009)(圖5)。在第21天，與給予蛋白的對(duì)照組相比免疫毒素能降低博萊霉素誘導(dǎo)的PF小鼠肺部TNF-α，趨化因子CCL2和CCL12細(xì)胞的數(shù)量(均P=0.000)(圖6、7)。

a:P<0.05，與對(duì)照組相比

圖4免疫毒素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠的存活率的影響

A:免疫毒素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠的纖維化程度的影響;B：免疫毒素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)影響(相對(duì)表達(dá)量)；C：免疫毒素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠羥脯氨酸水平的影響；a:P<0.05，與對(duì)照組相比

圖5免疫毒素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)PF小鼠的纖維化程度、巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)及羥脯氨酸水平的影響

A:TNF-α的細(xì)胞數(shù)量;B：趨化因子CCL2的細(xì)胞數(shù)量；C：趨化因子CCL12的細(xì)胞數(shù)量；a:P<0.05，與對(duì)照組相比

圖7免疫毒素對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的PF小鼠肺部TNF-α、趨化因子CCL2和CCL12細(xì)胞數(shù)量的影響(相對(duì)表達(dá)量)

3 討 論

本研究中發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，UIP患者的肺組織中可以觀察到大量能表達(dá)FRβ的間質(zhì)巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。正常組織的巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)很有限，巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)主要存在于博來霉素誘導(dǎo)形成PF的纖維化病灶中。隨著PF的進(jìn)展，博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺組織中巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)數(shù)目逐漸增加。表達(dá)FRβ的巨噬細(xì)胞在PF肺部中首次出現(xiàn)，小鼠經(jīng)鼻內(nèi)滴注免疫毒素，能夠減少肺內(nèi)羥脯氨酸的含量以及減輕肺纖維化的程度，從而增加了博來霉素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠的存活率。

由巨噬細(xì)胞釋放的TGF-β1被認(rèn)為可作用于局部的成纖維細(xì)胞[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在博來霉素誘導(dǎo)形成PF的早期，巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)會(huì)釋放TGF-β1，這表明這些細(xì)胞可能直接參與小鼠PF的發(fā)病過程。在第14天用免疫毒素也未能提高PF小鼠的存活率，這可能與其他細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1相關(guān)。研究結(jié)果表明，表達(dá)FRβ的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1可能主要作用于博來霉素誘導(dǎo)PF發(fā)病過程的初始階段。

由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的CCL2、CCL12和CCL3趨化因子已確定為促纖維化介質(zhì)[10]。CCR2(CCL2和CCL12的受體)或CCR5(CCL3的受體)的缺乏能抑制纖維化的發(fā)展[11]。白細(xì)胞介素(IL)-13已被證明有助于PF的發(fā)展，其可能通過誘導(dǎo)CCL2、CCL3而實(shí)現(xiàn)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼻給予免疫毒素可減少促纖維化細(xì)胞因子TNF-α、CCL2和CCL12的細(xì)胞數(shù)量，降低博來霉素誘導(dǎo)PF中巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)，可減少由炎癥巨噬細(xì)胞所釋放的各種促纖維化細(xì)胞因子。因此，靶向消除巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)將比靶向消除個(gè)體巨噬細(xì)胞所釋放的促纖維化細(xì)胞因子更有效。

有研究表明，使用抗CD11b 或抗CD11a的mAb能夠?qū)Σ﹣砻顾卣T導(dǎo)小鼠形成的PF起到抑制作用[14]。然而，這些治療可能會(huì)抑制先天免疫，因?yàn)镃D11a、CD11b位于單核細(xì)胞和駐留型巨噬細(xì)胞。有研究表明，使用CD11b的單克隆抗體治療，會(huì)加重大腸桿菌肺炎小鼠的病情[15]。與表達(dá)CD11b或 CD11a的細(xì)胞相反，正常組織的巨噬細(xì)胞中FRβ表達(dá)是很有限的。因此，通過FRβ靶向清除炎癥巨噬細(xì)胞對(duì)于治療IPF患者是非常理想的治療辦法，同時(shí)該治療方式也不會(huì)影響單核細(xì)胞和駐留型巨噬細(xì)胞的正常功能。隨著免疫核糖核酸酶(immuneRNase)的發(fā)現(xiàn)，且其中的毒素部分和免疫球蛋白片段分別被人類核糖核酸酶和人源化免疫球蛋白替代后[16]，作用于FRβ的免疫毒素的毒性和免疫原性這一缺陷也將被克服。一旦免疫RNA酶中的RNase部分被內(nèi)化，其將發(fā)揮RNA降解活性，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞的死亡。由于正常組織不表達(dá)或低水平表達(dá)葉酸受體，而大多數(shù)葉酸受體對(duì)FRα比對(duì)FRβ具有更高的結(jié)合親和力，因此也可使用葉酸拮抗劑[17]。IPF具有異質(zhì)性特征，其表現(xiàn)為在正常表觀的肺部中交替出現(xiàn)外周纖維化、間質(zhì)炎癥和蜂窩狀態(tài)改變的區(qū)域。這些炎癥成分主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞組成[18]。在診斷IPF時(shí)，若不行肺部穿刺活檢，則很難確定激活的巨噬細(xì)胞的分布。由于放射性葉酸靶向藥物與葉酸受體結(jié)合其主要集中于激活的巨噬細(xì)胞[19]。因此通過FolateScan對(duì)表達(dá)FR細(xì)胞的圖像化[20]，將有助于預(yù)測(cè)最佳治療時(shí)機(jī)和監(jiān)測(cè)靶向治療巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)對(duì)IPF患者的療效。

綜上所述，人和PF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺部的炎性巨噬細(xì)胞均可表達(dá)FRβ。選擇性降低巨噬細(xì)胞的FRβ表達(dá)能顯著抑制博來霉素誘導(dǎo)PF的病理過程，因此也意味著靶向治療表達(dá)FRβ的巨噬細(xì)胞可能會(huì)為IPF的治療帶來希望。

[1]WILSON M S,WYNN T A.Pulmonary fibrosis:pathogenesis,etiology and regulation[J].Mucosal Immunol,2009,2(2):103-121.

[2]QU Y,ZHANG G,JI Y,et al.Protective role of gambogic acid in experimental pulmonary fibrosis in vitro and in vivo[J].Phytomedicine,2016,23(4):350-358.

[3]HOMOLKA J,ZIEGENHAGEN M W,GAEDE K I,et al.Systemic immune cell activation in a subgroup of patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J].Respiration,2003,70(3):262-269.

[4]LI X W,LI X H,DU J,et al.Calcitonin gene-related peptide down-regulates bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Can J Physiol Pharmacol,2016,94(12):1315-1324.

[5]DELLA-LONGA S,ARCOVITO A.Intermediate states in the binding process of folic acid to folate receptor α:insights by molecular dynamics and metadynamics[J].J Comput Aided Mol Des,2015,29(1):23-35.

[6] American Thoracic Society.Idiopathic pulmonary fibrosis:diagnosis and treatment.International consensus statement.American Thoracic Society(ATS),and the European Respiratory Society(ERS)[J].Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2 Pt 1):646-664.

[7]GHARAEE-KERMANI M,ULLENBRUCH M,PHAN S H.Animal models of pulmonary fibrosis[J].Methods Mol Med,2005,117:251-259.

[8]ASHCROFT T,SIMPSON J M,TIMBRELL V.Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale[J].J Clin Pathol,1988,41(4):467-470.

[9]ZHANG Y,WANG J,LI H,et al.Hydrogen sulfide suppresses transforming growth factor-β1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts[J].Sci China Life Sci,2015,58(11):1126-1134.

[10]WU X,GUAN Y,YAN J,et al.ShenKang injection suppresses kidney fibrosis and oxidative stress via transforming growth factor-β/Smad3 signalling pathway in vivo and in vitro[J].J Pharm Pharmacol,2015,67(8):1054-1065.

[11]MOORE B B,KOLODSICK J E,THANNICKAL V J,et al.CCR2-mediated recruitment of fibrocytes to the alveolar space after fibrotic injury[J].Am J Pathol,2005,166(3):675-684.

[12]MURRAY L A,ZHANG H,OAK S R,et al.Targeting interleukin-13 with tralokinumab attenuates lung fibrosis and epithelial damage in a humanized SCID idiopathic pulmonary fibrosis model[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2014,50(5):985-994.

[13]DING M,SHENG H,SHEN W,et al.Association of the SNP rs1800925(C/T)in the interleukin-13 gene promoter with pulmonary function in Chinese Han patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J].Cell Biochem Biophys,2013,67(3):905-909.

[14]SKURIKHIN E G,KHMELEVSKAYA E S,ERMAKOVA N N,et al.Effect of spiperone on mesenchymal multipotent stromal and hemopoietic stem cells under conditions of pulmonary fibrosis[J].Bull Exp Biol Med,2014,157(1):132-137.

[15]BELPERIO J A,DY M,BURDICK M D,et al.Interaction of IL-13 and C10 in the pathogenesis of bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2002,27(4):419-427.

[16]PULIDO D,MOUSSAOUI M,NOGUES M V,et al.Towards the rational design of antimicrobial proteins:single point mutations can Switch on bactericidal and agglutinating activities on the RNase A superfamily lineage[J].FEBS J,2013,280(22):5841-5852.

[17]YANG T Y,CHANG G C,HSU S L,et al.Effect of folic acid and vitamin B12 on pemetrexed antifolate chemotherapy in nutrient lung cancer cells[J].Biomed Res Int,2013(2013):389046.

[18]FARBER S.FARBER S.Some observations on the effect of folic acid antagonists on acute leukemia and other forms of incurable cancer.Blood.1949;4(2):160-167[J].Blood,2016,127(3):271.

[19]GUARIENTO A H,FURTADO K S,DE CONTI A,et al.Transcriptomic responses provide a new mechanistic basis for the chemopreventive effects of folic acid and tributyrin in rat liver carcinogenesis[J].Int J Cancer,2014,135(1):7-18.

[20]MATTESON E L,LOWE V J,PRENDERGAST F G,et al.Assessment of disease activity in rheumatoid arthritis using a novel folate targeted radiopharmaceutical Folatescan[J].Clin Exp Rheumatol,2009,27(2):253-259.