魯 坤, 曹永紅

(1.隴南市林業(yè)局，甘肅 隴南 746000；2.隴南市經(jīng)濟(jì)林研究院花椒研究所，甘肅 隴南 746000)

花椒是指蕓香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和青椒(Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.)的干燥成熟果皮[1]?；ń吩谖覈?guó)的使用有著悠久的歷史，作為一味傳統(tǒng)中藥材，具有溫中散寒、除濕和殺蟲(chóng)止痛等作用；作為一種食用香辛料，被譽(yù)為“八大味”之一，也是川菜的主要調(diào)味品之一[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)花椒最重要的用途是香辛料，用于食品的烹調(diào)加工調(diào)味，有賦香、著色、防腐、掩蓋異味及增加食欲等作用[3]。

隴南地處亞熱帶向暖溫帶過(guò)渡氣候區(qū),境內(nèi)高山、河谷、丘陵、川壩、盆地錯(cuò)落相間，海拔在550―4200m之間，年平均氣溫15℃，氣候濕潤(rùn)、無(wú)霜期長(zhǎng)、光熱資源豐富。優(yōu)越的氣候特點(diǎn)，為花椒的發(fā)展提供了得天獨(dú)厚的條件，所產(chǎn)隴南“大紅袍”花椒以果皮丹紅、粒大飽滿、芳香濃郁、麻味醇厚而久負(fù)盛名[4]。

內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)特殊環(huán)境中并與之協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中形成了互惠關(guān)系，一方面，植物為內(nèi)生菌提供其光合作用產(chǎn)物和礦物質(zhì)以滿足其生長(zhǎng)必需的能量和營(yíng)養(yǎng)需要；另一方面，內(nèi)生菌通過(guò)自身代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào)傳導(dǎo)作用對(duì)宿主產(chǎn)生影響。甚至發(fā)現(xiàn)[5]內(nèi)生菌不僅能參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成、促進(jìn)其生成、積累及對(duì)其的轉(zhuǎn)化，還能獨(dú)立產(chǎn)生與宿主相同或相類似的生物活性物質(zhì)，是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。1993年美國(guó)蒙大拿州立大學(xué)Stierle[6]等首次報(bào)道從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的韌皮部分離到一株能產(chǎn)生抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌(Taxomycesandreanae)，掀起了在植物內(nèi)生菌中尋找新物質(zhì)的熱潮，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道很多[7―13]。但是，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)花椒的研究主要著眼于其生物性狀與組織鑒別、化學(xué)成分分析[14]、藥理研究[15]、相關(guān)產(chǎn)品加工應(yīng)用[16]等方面，但對(duì)于花椒內(nèi)生菌的研究較少，未見(jiàn)有關(guān)花椒枝葉片內(nèi)生細(xì)菌物種多樣性的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)隴南花椒種植區(qū)樣品的采集，對(duì)存在于花椒葉片中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分離和鑒定，旨在為花椒內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考，特別是在為利用花椒內(nèi)生菌研制生物源農(nóng)藥方面提供直接依據(jù)。

1.材料和方法

1.1樣品采集

從甘肅隴南各花椒種植區(qū)，參考平行線取樣法[17]，采集健康和感病的4―8年樹(shù)齡的花椒樹(shù)枝葉片20份，共計(jì)360份，裝入封口袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室放入4度冰箱備用。

1.2培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0g，蛋白脈10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000ml，pH值7.0。

1.3內(nèi)生菌的分離

采用預(yù)實(shí)驗(yàn)中摸索的條件對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒，即將采集的花椒葉片分別稱重。將樣品用自來(lái)水沖洗20分鐘，用濾紙片吸取表面的水分；放入2%的次氯酸鈉中表面消毒2分鐘，用滅菌的濾紙片吸干表面的液體；再放入75%的酒精中滅菌3分鐘，經(jīng)過(guò)表面消毒的樣品用無(wú)菌水漂洗3次，每次2分鐘，再用無(wú)菌濾紙片吸干表面水分后用于內(nèi)生菌的分離。驗(yàn)證樣品表面消毒是否徹底，取第三次漂洗的水樣200μl分別涂布于NA培養(yǎng)基平板中，用封口膜將平板封口后于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，如果平板上沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，證明消毒徹底。

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將消毒徹底的樣品放入無(wú)菌研缽中，加入10ml無(wú)菌水進(jìn)行研磨，用無(wú)菌的兩層擦鏡紙進(jìn)行過(guò)濾去除組織殘?jiān)?，?ml濾液用無(wú)菌水梯度稀釋到10-3，取該稀釋度的樣品200μl，涂布到NA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，用封口膜將平板封口后放入32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3―5天，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，再根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色挑取和純化內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)每一組樣品，從培養(yǎng)基平板上純化20株內(nèi)生細(xì)菌。

1.4內(nèi)生生防菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

用細(xì)菌DNA提取試劑盒(BioTeke Co-poration，China，Cat#DP2001)按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。以試劑盒提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用通用引物27F(5'―AGAGTTTGATCCTGGCTCAG―3')和1492R (5'―GGTTACCTTGTTACGACTT―3')擴(kuò)增 16S rRNA 基因。PCR反應(yīng)體系(50μL):10×PCR buffer(2.5 mmol/L)5.0μL，10 mmol/L dNTPs(2.5 mmol/L)4.0μL，27F(10μmol/L)2.0μL，1492R(10μmol/L)2.0μL，TaqDNA聚合酶(5UμL―1)0.5μL，DNA 2.0μL，ddH20，34.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min，95℃變性1min，50℃退火1 min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。獲得的DNA序列提交到GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)。將測(cè)序獲得的序列分別與GenBank上的序列進(jìn)行BLAST相似性比較并下載與目標(biāo)序列同源性最高的同源序列。將目標(biāo)序列及其同源序列合并保存為單一的Fasta文件，多序列的比對(duì)排列依靠軟件ClustalX[18]，并進(jìn)行手工校對(duì)，再用Bioedit軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行手工調(diào)整以提高比對(duì)質(zhì)量。分別采用MEGA(版本:6.06)軟件包中的Kimura two―parameter矩陣模型和Neighbor―joining法進(jìn)行親緣距離的計(jì)算和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，對(duì)Gap的處理采用Pair-wise Deletion。采用重抽樣法(Bootstrapping)對(duì)分枝節(jié)點(diǎn)的置信度進(jìn)行評(píng)價(jià)，Bootstrap抽樣重復(fù)次數(shù)為1000次。

2.結(jié)果

2.1花椒葉片內(nèi)生細(xì)菌生物量

本次實(shí)驗(yàn)中分離的到的花椒葉片內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量為2.8×105CFU/g。

2.2花椒內(nèi)生細(xì)菌的物種多樣性

基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，50株花椒內(nèi)生細(xì)菌歸屬于厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)(表1,圖1)。在分析的內(nèi)生細(xì)菌中，屬于壁厚菌門(mén)(Firmicutes)的種類在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，共有42株株，占總數(shù)的84%。變形菌門(mén)有7株占總數(shù)的14%，放線菌門(mén)有1株，占總數(shù)的2%。

在厚壁菌門(mén)的42株菌株，屬于6個(gè)屬，19個(gè)種，其中芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)在數(shù)量上占優(yōu)，共有36株，占該類群的85.70%。在芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)中共有13個(gè)種，B.timonensis和B.siamensis為優(yōu)勢(shì)種，分別有11株(占芽孢桿菌屬菌株總數(shù)的30.56%)和8株(22.22%)，這些菌株與其近緣種的同源相似性分別為98.2―99.2%和99.79―99.93%，余下的17個(gè)菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)的11個(gè)種(相似性98.05%―99.86%)，B.aryabhattai(3株)，B.altitudinis(3株)，B.safensis(2株)和B.velezensis(2株)，B.zhangzhouensis(1株)、B.subterraneus(1株)、B.oryzisoli(1株)、B.oceanisediminis(1株)、B.mesonae(1株)、B.depressus(1株)，B.atrophaeus(1株)；厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的另外6個(gè)菌株中，1株屬于Brevibacilluspanacihumi，1株屬于B.formosus，1株屬于Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum1株屬于Paenibacilluslautus1株屬于Lysinibacillusmacroides1株屬于Terribacillusaidingensis，相似性均大于98.56%。

共有6株內(nèi)生菌屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)，占總菌株的12%這些菌株分屬于5個(gè)屬5個(gè)種，2株屬于Paracoccussanguinis(相似性99.92%)，1株屬于Serratiamarcescenssubsp.marcescens(相似性99.93%)，1株屬于Brevundimonasvesicularis(相似性99.70%)，1株屬于Alcaligenesfaecalissubsp.faecalis(相似性99.93%)；1株屬于Achromobacterspanius(相似性99.86%)。

共有1株內(nèi)生菌屬于放線菌門(mén)(Actinobacteria)，占總菌株的2%，屬于Micrococcusendophyticus(相似性99.93%)。

3.討論

植物內(nèi)生菌在植物中無(wú)所不在，幾乎在所有研究過(guò)的組織中均有分布[19]。植物內(nèi)生菌有利于宿主植物，其中的一些種類也有利于人類，比如內(nèi)生菌的細(xì)胞或代謝產(chǎn)物在在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及工業(yè)上的應(yīng)用[20]。相對(duì)而言，內(nèi)生菌比植物附生菌和土壤微生物在植物體內(nèi)的生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)上更占優(yōu)勢(shì)[21―23]，因此，內(nèi)生菌常被認(rèn)為是研發(fā)生物肥料和生防制劑的良好資源[19,22,24―26]。目前，很多植物種類的內(nèi)生菌已被報(bào)道，但花椒樹(shù)枝葉片內(nèi)生細(xì)菌物種多樣性的研究很少。本研究從花椒樹(shù)枝葉片中分離得到5000株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)顏色、形態(tài)、生長(zhǎng)量等指標(biāo)，篩選出50株內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其種類多樣性進(jìn)行了分析。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，本研究花椒內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析屬首次報(bào)道。

本研究從花椒樹(shù)枝葉片中分離內(nèi)生細(xì)菌，以期得到花椒內(nèi)生細(xì)菌的分布特征。Firmicute門(mén)的菌株出現(xiàn)頻率最高，尤其是Bacillus屬的菌株。芽孢桿菌(Bacillusspp.)在土壤、植物體內(nèi)和水等生態(tài)環(huán)境作為優(yōu)勢(shì)種已被廣泛報(bào)道[27―30]。

花椒作為甘肅隴南的主要經(jīng)濟(jì)林作物和當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源的特色產(chǎn)業(yè)。目前為止，未見(jiàn)針對(duì)花椒內(nèi)生細(xì)菌物種多樣性的研究報(bào)道，本研究分離得到花椒內(nèi)生細(xì)菌26個(gè)種，為花椒內(nèi)生菌物種多樣性提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)，也為開(kāi)發(fā)利用內(nèi)生菌防治花椒病害打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。