朱靜嫻 李麗君 趙淑芳 陳宸 姜淑霞

摘要：利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外不同來源的23株大球蓋菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從288對(duì)引物中篩選出穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、多態(tài)性穩(wěn)定并能擴(kuò)增出清晰明亮條帶的38對(duì)引物。通過SRAP擴(kuò)增圖譜分析得出，以基因組DNA為模板的23株菌株擴(kuò)增片段分子量在100～2 000 bp間，共擴(kuò)增出322個(gè)位點(diǎn)，其中有205個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比率為63.66%；供試菌株間的遺傳相似系數(shù)為0.6646～0.9658；采用UPGMA法對(duì)擴(kuò)增圖譜進(jìn)行聚類分析，在相似水平0.84時(shí)可將23株菌株分為3個(gè)類群，第Ⅰ類群為來自國(guó)外的2株菌株；第Ⅱ類群為本實(shí)驗(yàn)室馴化篩選的3株耐高溫品種，第Ⅲ類群為國(guó)內(nèi)不同地市的18株菌株。結(jié)果表明，不同大球蓋菇菌株間存在明顯遺傳多樣性，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可將23株供試菌株鑒別開，且能分析出不同菌株間的親緣關(guān)系。本研究可為大球蓋菇菌株親緣關(guān)系的鑒定及新品種選育提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大球蓋菇；SRAP分子標(biāo)記；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

中圖分類號(hào)：S646.1+90.24文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）03-0022-07

Abstract Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker technique was used to study the genetic diversity and phylogenetic relationship among 23 Stropharia rugosoannulata strains collected from home and abroad. A total of 288 pairs of SRAP primers were tested， and 38 pairs could produce high-quality PCR production with good stability， repeatability and polymorphism. The analysis of SRAP amplification pattern showed that 322 bands were amplified from genomic DNA of 23 strains with the size of 100～2 000 bp， of which 205 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic sites was 63.66%. The genetic similarity coefficient among the tested strains was ranged from 0.6646～0.9658. The cluster analysis proceeded by UPGMA method showed that 23 strains could be divided into three major groups at the similarity coefficient of 0.84. Group Ⅰ included two strains from abroad； Group Ⅱ included three high temperature resistant strains domesticated by our laboratory； Group Ⅲ were 18 strains cultivated or preserved in different cities in China. The results showed that significant genetic diversity existed among the strains. SRAP molecular marker technique could identify 23 strains clearly and analyze the phylogenetic relationship among different strains. This test provides the theoretical basis for the identification of Stropharia rugosoannulata phylogenetic relationship and new strain breeding.

Keywords Stropharia rugosoannulata； SRAP molecular marker； Genetic diversity； Phylogenetic relationship

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata Farl. ex Murrill）別名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇，屬于擔(dān)子菌門，層菌綱，傘菌目，球蓋菇科，球蓋菇屬[1]。大球蓋菇是優(yōu)良的食、藥用菌，其菇體大、色艷、質(zhì)脆清香、營(yíng)養(yǎng)豐富，有預(yù)防冠心病、助消化、緩解精神疲勞等多種保健價(jià)值，是國(guó)際菇類交易市場(chǎng)上的十大菇種之一，也是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）向發(fā)展中國(guó)家推薦栽培的食用菌之一[2]。野生大球蓋菇于20世紀(jì)初在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，并于1969年在德國(guó)人工馴化栽培成功，隨后波蘭、捷克斯洛伐克、匈牙利等國(guó)家相繼引種栽培。我國(guó)大球蓋菇野生資源主要分布于云南、西藏、四川、山西、新疆、遼寧、吉林等地[3]。20世紀(jì)80年代，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所從波蘭引進(jìn)該菌種并在國(guó)內(nèi)首次試栽成功，進(jìn)而福建省三明真菌研究所對(duì)其栽培研究取得良好效益[4]。近年來，大球蓋菇在福建、浙江、陜西、河北、遼寧、山東多省以各種栽培模式迅速發(fā)展，栽培前景十分廣闊。

SRAP分子標(biāo)記是一種基于PCR的新型標(biāo)記系統(tǒng)，目前廣泛應(yīng)用于植物物種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，相對(duì)于其他分子標(biāo)記方法，SRAP分子標(biāo)記在植物物種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中能獲得更多的信息[5-9]。該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高重復(fù)率、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)，并已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建性狀的標(biāo)記和遺傳多樣性分析[10]。SRAP標(biāo)記技術(shù)已在木耳、金針菇、靈芝、雞腿菇、香菇、蘑菇屬等食用菌上得到應(yīng)用[11-16]。本研究采用SRAP分子標(biāo)記，對(duì)收集到的國(guó)內(nèi)外23株大球蓋菇進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確其菌株間的親緣關(guān)系，以期為大球蓋菇菌株資源的保護(hù)和下一步育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)所用的23株大球蓋菇菌株均由山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。具體菌株編號(hào)、名稱、來源及產(chǎn)地見表1。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值6.5。

1.3 耐高溫大球蓋菇菌株的獲得及供試菌絲體制備

1.3.1 耐高溫菌株的獲得 將活化好的22株備選菌株（表2）置于25℃條件下培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)培養(yǎng)箱中，程序設(shè)置為34℃和25℃交替循環(huán)，34℃持續(xù)8 h，25℃16 h，連續(xù)處理14個(gè)循環(huán)。剔除其中生長(zhǎng)緩慢、畸形的菌株，將剩余菌株轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)皿上，25℃培養(yǎng)5 d后，將程序設(shè)置為38℃ 6 h和25℃18 h，連續(xù)處理14個(gè)循環(huán)。再剔除表現(xiàn)不好的菌株，將程序設(shè)置為42℃ 4 h和25℃ 20 h，連續(xù)處理14個(gè)循環(huán)。選取其中生長(zhǎng)速度較快、菌絲潔白粗壯的菌株作為耐高溫備選株并通過繼代培養(yǎng)進(jìn)行耐高溫穩(wěn)定性驗(yàn)證。驗(yàn)證方法為：將篩選獲得的耐高溫備選株連續(xù)培養(yǎng)20代，分別取5、10、15、20代置于42℃條件下培養(yǎng)4 h，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，獲得耐高溫性穩(wěn)定的菌株作為耐高溫菌株。

1.3.2 大球蓋菇菌絲體制備 將23株大球蓋菇菌株在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d后，轉(zhuǎn)接到鋪有玻璃紙的新鮮PDA平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)10 d后，分別刮取200 mg新鮮菌絲備用。

1.4 23株大球蓋菇DNA提取、擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

取200 mg新鮮菌絲放入研缽，倒入液氮迅速研磨成粉末，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照。以標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量作對(duì)照，用紫外吸收法檢測(cè)DNA濃度并稀釋成50 ng/μL，貯存于-20℃冰箱中備用。

SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系：反應(yīng)體積25 μL，其中2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，100 μmo1/L上、下游引物各1 μL，模板為50 ng/μL DNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積。

SRAP擴(kuò)增基準(zhǔn)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

取擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)以DL 2000 DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，100 V恒壓電泳40～60 min，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.5 SRAP引物及反應(yīng)條件篩選

采用Li等[17]2001年發(fā)表的引物，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成（表3）。正向引物16條，反向引物18條，采用Me-Em的組合表示方式共得到288對(duì)引物。選用3株大球蓋菇DNA對(duì)288對(duì)引物進(jìn)行初步篩選，將重復(fù)性好、強(qiáng)度較高、清晰可辨無爭(zhēng)議、能體現(xiàn)菌株間差異的條帶確認(rèn)為標(biāo)記條帶，進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)和分析以篩選出最佳組合引物。

SRAP-PCR反應(yīng)體系退火溫度的優(yōu)化：選用編號(hào)為1、5和14菌株的DNA作為模板，用2對(duì)引物（Me5、Em4和Me7、Em9）進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)退火溫度進(jìn)行篩選，溫度設(shè)置為32、32.1、32.4、32.8、33.2、33.7、34.2、34.7、35.2℃、35.6、35.9、36℃。溫度確定后另選3株大球蓋菇DNA模板對(duì)SRAP-PCR體系進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 SRAP電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)及處理分析

將相同引物 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的標(biāo)記條帶確認(rèn)為同一條帶，擴(kuò)增陽(yáng)性記錄為“ 1”，擴(kuò)增陰性記錄為“ 0”，把圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料，統(tǒng)計(jì)形成“ 0/1”表型數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)該數(shù)據(jù)矩陣統(tǒng)計(jì)算出多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)比率 P（Percentage of polymorphic sites），估算遺傳分化的水平。

計(jì)算公式：P=k/n×100%。

式中P為多態(tài)位點(diǎn)比率，k為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，n為擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)。

利用POPGENE 1.32軟件計(jì)算各菌株間的Neis遺傳相似系數(shù)（GS）、遺傳距離（GD）、Neis遺傳多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I），并利用NTSYS-PC軟件進(jìn)行菌株間的非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析，生成遺傳距離聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物篩選及其擴(kuò)增結(jié)果分析

288對(duì)引物中共篩選出38對(duì)重復(fù)性好、多態(tài)性比率高的引物。利用38對(duì)引物對(duì)23株大球蓋菇基因組DNA進(jìn)行SRAP擴(kuò)增并電泳檢測(cè)，共擴(kuò)增出322個(gè)位點(diǎn)，其條帶分子量大小在100～2 000 bp之間。其中多態(tài)性位點(diǎn)205個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率為63.66%。38對(duì)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)從4～12個(gè)不等，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出8.47個(gè)位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為5.39個(gè)（表4）。引物Me5-Em1對(duì)23株大球蓋菇菌株的SRAP圖譜見圖1。

基于23株供試菌株的SRAP擴(kuò)增多態(tài)性，利用POPGENE 1.32軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，樣品間的平均Neis遺傳多樣性指數(shù)為0.1616，平均Shannon指數(shù)為0.2577，說明供試菌株間的遺傳多樣性較高，遺傳差異性較大。

2.2 聚類分析

由圖2可以看出23株大球蓋菇菌株兩兩間的相似性系數(shù)范圍為0.6646～0.9658。菌株編號(hào)6與7的相似性系數(shù)為0.9658，親緣關(guān)系最近，菌株編號(hào)2與19的相似性系數(shù)為0.6646，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

從圖3可以看出，23株供試菌株均可以鑒別開。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.84時(shí)，23株大球蓋菇供試菌株被分為3個(gè)類群：第Ⅰ類群為來源于國(guó)外的編號(hào)為1號(hào)和2號(hào)的菌株；第Ⅱ類群為本實(shí)驗(yàn)室耐高溫馴化后篩選的3株菌株（菌株編號(hào)為18、19和20）；第Ⅲ類為來自國(guó)內(nèi)13個(gè)不同地市的18株菌株。其中，第Ⅱ類群的3株菌株之間的親緣關(guān)系與其原發(fā)菌株（菌株編號(hào)為15、16和17）之間的親緣關(guān)系相似，即原發(fā)菌株16和17聚在一支，與15較遠(yuǎn)，耐高溫菌株中的19和20同樣聚在一起，與18較遠(yuǎn)；第Ⅲ類群中，源自云南子實(shí)體顏色為黃色的菌株（菌株編號(hào)為21、22、23）聚在一起，來自山東濟(jì)寧的4株菌株（菌株編號(hào)為14、15、16、17）聚在一起；黑龍江（菌株編號(hào)為9、13）、遼寧（菌株編號(hào)為5、8、10）、山東濟(jì)南（菌株編號(hào)為6）、山東臨沂（菌株編號(hào)為4）、山東泰安（菌株編號(hào)為7）的菌株與三明真菌研究所保存的菌種（菌株編號(hào)為11）遺傳距離較近。

結(jié)果表明：（1）本試驗(yàn)中多個(gè)地理位置相距較近的菌株聚在一進(jìn)化支上，說明供試菌株間的遺傳相似性與它們的地理位置有一定的相關(guān)性；部分地理位置與氣候條件相差較大的栽培菌株也有聚在一個(gè)進(jìn)化支上，說明多個(gè)大球蓋菇品種有互相交流或引種異地栽培狀況。（2）3株耐高溫菌株間的相似性系數(shù)較高，與馴化前的3株原發(fā)菌株有一定的差異，說明長(zhǎng)期在高溫條件下培養(yǎng)的菌株，為了適應(yīng)高溫環(huán)境，部分基因發(fā)生了相應(yīng)變異。但從它們的遺傳相似性與其他菌株相比較仍然較高，其親緣關(guān)系明顯近于其他菌株，說明SRAP分子標(biāo)記技術(shù)能高效鑒別大球蓋菇菌株。（3）黃色菌株之間親緣關(guān)系較近，雖然同樣聚在第Ⅲ類群但是與國(guó)內(nèi)其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明表型顏色不同的品種在基因上也有一定差異。

為進(jìn)一步明確大球蓋菇菌株遺傳多樣性與其地理來源的關(guān)系，將20株（菌株編號(hào)為18、19、20除外）大球蓋菇按照其地理來源分為8個(gè)群體。采用POPGENE 1.32軟件計(jì)算不同地理來源的大球蓋菇群體間遺傳相似性系數(shù)Neis和遺傳距離（表5）。由表5可以看出：8個(gè)群體的遺傳相似性系數(shù)為0.7422～0.9584，其中遼寧群體和黑龍江群體相似性系數(shù)最高，為0.9584，說明其親緣關(guān)系最近。而四川和大阪兩個(gè)群體間的相似性系數(shù)最小為0.7422，可能由其地理位置相隔較遠(yuǎn)，生境差別較大，對(duì)基因交流產(chǎn)生了一定的障礙，因而相似性系數(shù)較小。根據(jù)群體間遺傳相似性系數(shù)，運(yùn)用POPGENE軟件進(jìn)行聚類（圖4）。由圖4可以看出遼寧地區(qū)和黑龍江地區(qū)的菌株親緣關(guān)系最近，其次為山東地區(qū)，這些居群間的地理位置接近，氣候條件類似，在長(zhǎng)期自然選擇條件下，基因保持著較小的遺傳距離。

3 討論與結(jié)論

SRAP技術(shù)現(xiàn)目前廣泛應(yīng)用于食用菌的菌株分子鑒定、分類學(xué)研究、遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析等方面。許曉燕等[18]應(yīng)用SRAP和AFLP標(biāo)記對(duì)19株毛木耳進(jìn)行了遺傳多樣性分析；Sun等[19]采用SRAP標(biāo)記對(duì)31個(gè)靈芝商業(yè)栽培品種和野生菌種進(jìn)行了分類學(xué)及遺傳多樣性研究；盧政輝等[20]通過SRAP技術(shù)對(duì)不同地區(qū)的24個(gè)秀珍菇進(jìn)行了DNA指紋分析，獲得了它們的親緣關(guān)系；蔡志欣等[21]利用SRAP技術(shù)對(duì)32個(gè)茯苓菌株進(jìn)行了DNA指紋分析，找出了各菌株間的親緣關(guān)系，分析得到供試菌株間的遺傳背景，這均為食用菌遺傳學(xué)研究和育種提供了依據(jù)。

由于從菌絲及子實(shí)體形態(tài)上區(qū)分不同大球蓋菇品種比較困難，本研究通過SRAP技術(shù)成功對(duì)23株大球蓋菇菌株進(jìn)行鑒別，菌株間聚類分析結(jié)果表明，在不同遺傳相似系數(shù)水平上，供試菌株可分為多個(gè)亞群；不同亞群表明菌株間親緣關(guān)系與地理來源、耐高溫馴化和不同的表型有關(guān)，體現(xiàn)了大球蓋菇種內(nèi)遺傳多樣性豐富；國(guó)內(nèi)20株供試菌株被全部區(qū)分開，表明該技術(shù)可用于大球蓋菇不同菌株的遺傳背景分析，適用于親緣關(guān)系鑒定。本研究選用的供試大球蓋菇菌株包含國(guó)家認(rèn)證品種、國(guó)內(nèi)大部分主要栽培品種、黃色變異菌株以及耐高溫菌株，反映出菌株間親緣關(guān)系的整體情況，同時(shí)為品種分類鑒定和遺傳育種的親本選擇提供了理論依據(jù)。

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