魏海蓉 宗曉娟 朱東姿 譚鉞 徐麗 陳新 王甲威 劉慶忠

摘要：本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，通過RT-PCR從甜櫻桃品種‘美早果實(shí)中克隆出1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，將其命名為PaMYB10，GenBank登錄號(hào)為ALH21137.1。該基因編碼的氨基酸序列具有R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB家族基因，與薔薇科的桃、歐李、梅等作物親緣關(guān)系較近。qRT-PCR結(jié)果表明，PaMYB10在紅色品種‘美早的莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，在成熟果實(shí)中表達(dá)量最高?！涝缰谢ㄇ嘬蘸侩S著果實(shí)的發(fā)育逐漸升高，PaMYB10的表達(dá)顯著上調(diào)；‘13-33中花青苷含量隨著果實(shí)的發(fā)育變化不明顯，基因表達(dá)量變化也不明顯。在果實(shí)發(fā)育后期，‘美早果實(shí)中花青苷含量和PaMYB10的表達(dá)量均顯著高于‘13-33。推測PaMYB10的高水平表達(dá)可能與紅色甜櫻桃果實(shí)花青苷積累有關(guān)。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；花青苷；轉(zhuǎn)錄因子；MYB；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S662.5：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）03-0006-05

Abstract Based on our previous transcriptome data of sweet cherry fruit， the MYB transcription factor gene was cloned using RT-PCR method from sweet cherry cultivar ‘Tieton， and named PaMYB10. The sequence was submitted to GenBank with the accession number of ALH21137.1. Sequence analysis revealed that the deduced amino acid of PaMYB10 contained R2 and R3 conserved domain and it was a typical R2R3-MYB family gene. The encoded protein PaMYB10 had the closest genetic relationship with Prunus persica， Prunus domestica and Prunus mume. The result of qRT-PCR showed that PaMYB10 was expressed in stem， young leaf， flower and fruit tissues in red cultivar ‘Tieton， but the expression quantity was different. The expression quantity of PaMYB10 was the highest in the mature fruit of ‘Tieton. The content of anthocyanin in ‘Tieton increased gradually and the expression level of PaMYB10 showed significantly up-regulated along with the fruit development. However， the content of anthocyanin and expression level of PaMYB10 in the yellow cultivar ‘13-33 were almost unchanged and remained at a very low level during fruit ripening. In the later stage of fruit development， the content of anthocyanin and expression level of PaMYB10 in the red cultivar ‘Tieton were significantly higher than those of the yellow cultivar ‘13-33. It is speculated that the high level expression of PaMYB10 may associated with the anthocyanin accumulation in red sweet cherry fruit.

Keywords Sweet cherry； Anthocyanin； Transcription factor； MYB； Gene expression

在甜櫻桃果實(shí)中，花青苷的合成和積累是果皮呈現(xiàn)紅色的主要因素[1，2]。對(duì)甜櫻桃果實(shí)花青苷合成相關(guān)基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析，闡明甜櫻桃果實(shí)著色和花青苷代謝調(diào)控機(jī)理對(duì)改良果實(shí)品質(zhì)具有重要理論意義。

MYB是植物花青苷生物合成途徑中的重要調(diào)節(jié)因子，其與bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成MYB-bHLH-WD40三元復(fù)合體調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[3]。矮牽牛R2R3-MYB 基因MYB27與bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因AN1和花青苷合成結(jié)構(gòu)基因互作調(diào)控花青苷的代謝[4]。與花青素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子絕大多數(shù)為R2R3型，其主要調(diào)控花青素合成途徑中上游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，MYB-bHLH-WD40復(fù)合體調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[5]。目前已在多種果樹中鑒定出大量參與花青苷合成的MYB基因，如蘋果中的MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA等在蘋果果實(shí)花青苷合成過程中起重要調(diào)節(jié)作用[6-8]。歐洲紅色葡萄品種中VvMYBA1調(diào)控UFGT表達(dá)，促進(jìn)葡萄花色苷生物合成，而在綠色品種中不表達(dá)[9，10]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)花青苷的生物合成不僅具有正調(diào)控作用，還具有負(fù)調(diào)控作用，如在草莓中，F(xiàn)aMYB1抑制花青素的合成，而FaMYB10則促進(jìn)花青素的積累[11，12]。另外，在許多植物中，單個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)即可激活多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花青苷的積累[13，14]。目前關(guān)于甜櫻桃MYB與果實(shí)花青苷積累的響應(yīng)及調(diào)控機(jī)制報(bào)道較少[15]。

筆者課題組從前期的甜櫻桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字表達(dá)譜數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因中檢測到一批與花青苷合成相關(guān)的候選MYB基因。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，克隆了一個(gè)甜櫻桃MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，進(jìn)一步結(jié)合RT-PCR技術(shù)對(duì)其在不同組織、不同色澤品種的不同發(fā)育階段果實(shí)中的表達(dá)模式進(jìn)行研究，探討其與花青苷合成及果實(shí)色澤之間的關(guān)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證基因功能和深入挖掘后續(xù)基因奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用紅色甜櫻桃品種‘美早（Prunus avium L. Tieton）和純黃色品種‘13-33（P. avium L.13-33）為試材。試驗(yàn)于2014—2015年在山東省果樹研究所完成。隨機(jī)采集正常發(fā)育的幼葉、莖和花組織，立即用液氮速凍，用于RNA提??；分別采集花后20、35、45 d和55 d 4個(gè)發(fā)育階段正常發(fā)育的果實(shí)，從果實(shí)表面切取1～2 mm厚果肉（包含果皮），分別用錫紙包好，立即用液氮速凍，存于-80℃冰箱中用于提取RNA和花青苷含量測定。不同組織和不同發(fā)育階段果實(shí)樣品分別取3次重復(fù)。

1.2 總RNA的提取與cDNA合成

采用CTAB法提取甜櫻桃果實(shí)及其它組織總RNA[16]?？俁NA質(zhì)量分別采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoPhotometer 超微量蛋白質(zhì)核酸檢測儀（IMPLEN， Westlake Village， CA， USA）進(jìn)行檢測。利用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以O(shè)ligo（dT）18為引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 目的基因克隆

根據(jù)作者前期完成的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫信息（NCBI注冊號(hào)：SRP044388）[17]，獲得1條編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的unigene（comp26801_c1）。通過NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其具有完整的ORF。根據(jù)unigene ORF序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以甜櫻桃品種‘美早成熟果實(shí)的cDNA為模板，擴(kuò)增基因序列。反應(yīng)體系為：PCR Mix 12.5 μL，cDNA模板1.0 μL，F(xiàn)引物（10 μmol/L）1.0 μL、R引物（10 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的條帶，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，驗(yàn)證全長序列的準(zhǔn)確性。

1.4 序列分析和同源性比較

采用NCBI在線ORF Finder （http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 尋找開放閱讀框（ORF）；利用NCBI BLAST （ http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov） 進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索；挑選有代表性物種序列，采用DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。利用在線的ExPASY ProtParam Tool （http：//us.expasy.org/tools/ProtParam.html） 預(yù)測編碼蛋白的理化特性；通過ProtScale 軟件（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pI） 進(jìn)行疏水性/親水性分析。

1.5 基因表達(dá)分析

分別采用‘美早和‘13-33花后20、35、45 d和55 d 4個(gè)不同發(fā)育階段果實(shí)以及幼葉、莖和花的cDNA為模板，采用甜櫻桃β-ACTIN為內(nèi)參基因，按照熒光定量PCR的要求使用Beacon Designer 8 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。對(duì)cDNA模板稀釋20倍后，熒光定量PCR采用SYBRGreen PCR Master Mix（含ROX）在ABI PRISM7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR儀上完成。PCR反應(yīng)體系：SYBRGreen PCR Master Mix（With ROX）10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free H2O 8.2 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 95℃ 10 min；變性95℃ 15 s，退火/延伸55℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品3次重復(fù)。按照儀器默認(rèn)添加熔解曲線分析 95℃ 15 s，55℃ 1 min，95℃ 15 s，55℃ 15 s，以驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。擴(kuò)增曲線和樣品Ct值由儀器自帶軟件自動(dòng)生成。基因表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行。采用SPSS version 16.0進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

1.6 花青苷含量測定

甜櫻桃花青苷含量的測定參照王慧聰?shù)萚18]的方法。精確稱取鮮樣0.5 g，加液氮研磨后，準(zhǔn)確加入甲醇∶0.1%甲酸水（2∶8，V/V）提取液15 mL，超聲波振蕩10 min后，放入4℃冰箱浸提24 h。12 000 r/min離心15 min，收集上清液。測定提取液在553 nm和600 nm 處的吸光值，兩者之差即為花青苷的相對(duì)含量。差值每增加0.01定義為一個(gè)單位U。

2 結(jié)果與分析

2.1 PaMYB10的克隆及序列分析

通過對(duì)前期完成的甜櫻桃果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從差異表達(dá)基因中篩選出編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子的unigene（comp26801_c1）序列。通過NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列具有完整的ORF。根據(jù)unigene序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以甜櫻桃品種‘美早果實(shí)的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約950 bp 的片段（圖1）。測序結(jié)果表明，目的片段為935 bp。根據(jù)ORF同源性將其命名為PaMYB10（GenBank登錄號(hào)：ALH21137.1）。利用NCBI 中的ORF Finder 分析發(fā)現(xiàn)，PaMYB10的cDNA序列含有672 bp的ORF，編碼223個(gè)氨基酸，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中unigene的相應(yīng)序列完全一致。ProtParam 軟件分析顯示，PaMYB10蛋白的預(yù)測分子量為25.83，為堿性氨基酸。不穩(wěn)定系數(shù)為56.17，屬于不穩(wěn)定蛋白。親水性平均數(shù)為-0.818，預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。

2.2 PaMYB10的同源性及進(jìn)化分析

通過在線網(wǎng)站CDD 預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，PaMYB10具有R2和R3兩個(gè)MYB保守結(jié)構(gòu)域（圖2），該結(jié)構(gòu)域是R2R3型MYB家族基因所特有的。PaMYB10與其它R2R3-MYB家族成員在此區(qū)域高度保守。BLAST分析結(jié)果表明， PaMYB10與其它物種相應(yīng)蛋白的同源性較高。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖3）顯示，PaMYB10與薔薇科的桃和歐李聚為一類，其氨基酸序列一致性均達(dá)到84%以上，與薔薇科的梅等物種的親緣關(guān)系次之，其氨基酸序列一致性也達(dá)到了70%以上，而與葡萄、獼猴桃等物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 PaMYB10在不同組織中的表達(dá)特性分析

以β-ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，采用qRT-PCR方法對(duì)PaMYB10在甜櫻桃品種‘美早不同組織中的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖4）表明：PaMYB10在莖、幼葉、花、幼果和成熟果實(shí)中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，說明這些基因的表達(dá)具有一定的組織特異性。PaMYB10在成熟果實(shí)中表達(dá)量顯著高于莖、幼葉、花和幼果。

2.4 不同色澤甜櫻桃果實(shí)發(fā)育期間花青苷含量變化與PaMYB10表達(dá)的關(guān)系

為了進(jìn)一步分析甜櫻桃果實(shí)花青苷積累與PaMYB10的關(guān)系，測定了不同色澤甜櫻桃果實(shí)發(fā)育期間花青苷含量的變化以及PaMYB10的表達(dá)。如圖5所示，隨著果實(shí)的發(fā)育，紅色品種‘美早果實(shí)中的花青苷含量逐漸升高，特別是在轉(zhuǎn)色期（花后35 d）后迅速升高，由綠果期（花后20 d）的0.67 U/g FW上升至完熟期（花后55 d）的 197.4 U/g FW，升高了293.6倍。然而，黃色品種‘13-33整個(gè)果實(shí)發(fā)育期間，花青苷含量變化不明顯，且一直保持在極低含量水平。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，PaMYB10在紅色品種‘美早的果實(shí)發(fā)育期間的表達(dá)量逐漸升高，但在黃色品種‘13-33中的表達(dá)量極低，并且隨著果實(shí)的發(fā)育變化不明顯。從轉(zhuǎn)色期到完熟期，PaMYB10基因在紅色品種‘美早果實(shí)中的表達(dá)量均顯著高于黃色‘13-33果實(shí)。以上結(jié)果表明，甜櫻桃果實(shí)中花青苷的生物合成和積累可能與PaMYB10的高表達(dá)有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

MYB蛋白是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，調(diào)控著植物代謝的多個(gè)途徑，如生長發(fā)育、次生代謝和抗病等途徑[19]。根據(jù)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白包含保守的DNA結(jié)合區(qū)域（MYB結(jié)構(gòu)域）的個(gè)數(shù)，可以把MYB蛋白分為三類：R1-MYB、R2R3-MYB和R3-MYB[20]。參與調(diào)控花青苷生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子絕大多數(shù)為R2R3-MYB[4]。本試驗(yàn)在前期轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上從甜櫻桃品種‘美早果實(shí)中克隆出PaMYB10轉(zhuǎn)錄因子基因。PaMYB10屬于R2R3-MYB家族，具有R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，并且與其它物種R2R3-MYB家族成員在此區(qū)域高度保守。這與調(diào)控花青苷生物合成的其它R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相似。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，PaMYB10與薔薇科的桃、歐李、梅等作物親緣關(guān)系較近。

在草莓[12]、葡萄[10]、桃[21]和蘋果[22]等果樹中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在花青苷合成過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。蘋果MdMYB10參與蘋果葉片、果肉中花青苷生物合成的調(diào)控[6，22]。與蘋果MdMYB10直系同源的MYB轉(zhuǎn)錄因子在其它薔薇科物種中也得到鑒定，這些MYB轉(zhuǎn)錄因子均與果實(shí)花青苷生物合成有關(guān)[23，24]。Shen等從櫻桃中克隆得到的pacMYBA在成熟果實(shí)的果皮中表達(dá)量最高，在花青苷合成過程中起正調(diào)控作用[25]。本試驗(yàn)中，紅色品種‘美早果實(shí)顏色在由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色的過程中，花青苷含量由綠果期的0.67 U/g FW上升至完熟期（深紅色）的 197.4 U/g FW。然而，黃色品種‘13-33果實(shí)顏色在由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的過程中，花青苷含量變化不明顯，并且一直保持在極低含量水平。由此說明，甜櫻桃果實(shí)花青苷的積累是果實(shí)紅色形成的主要因素之一。從基因表達(dá)特性看，‘美早果實(shí)中PaMYB10的表達(dá)量隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸升高，在‘13-33果實(shí)發(fā)育過程中變化不明顯。在果實(shí)發(fā)育后期，‘美早果實(shí)中PaMYB10的表達(dá)量顯著高于‘13-33。通過對(duì)紅色品種‘美早不同組織的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PaMYB10的表達(dá)具有組織特異性，在成熟果實(shí)中表達(dá)量顯著高于幼果。綜合以上結(jié)果說明，PaMYB10的高水平表達(dá)可能與紅色甜櫻桃果實(shí)花青苷的積累有關(guān)。

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