任艷 李雙鈴 尹亮 崔瀟 李磊 石延茂 袁美

摘要：試驗(yàn)以花育20、花育45、魯花11無(wú)菌花生子葉為材料，采用3×3雙因子設(shè)計(jì)，研究3株發(fā)根農(nóng)桿菌菌株和花生品種對(duì)花生發(fā)根誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明：發(fā)根農(nóng)桿菌和花生品種均顯著影響發(fā)根誘導(dǎo)率。花育45的發(fā)根誘導(dǎo)率最高，為93.7%，其適宜菌株為A4；花育20的發(fā)根誘導(dǎo)率為89.2%，適宜菌株為ATCC15834；魯花11的發(fā)根誘導(dǎo)率為73.4%，適宜菌株為GIM1.141。

關(guān)鍵詞：發(fā)根農(nóng)桿菌；發(fā)根；誘導(dǎo)率；花生品種

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.2：S154.39文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）03-0103-04

Abstract Three Agrobacterium rhizogenes strains on the induction rate of hairy roots of peanut were investigated by 3×3 double-factor design with the cotyledon of sterile plantlets of Huayu 20， Huayu 45， Luhua 11 as meterials. The results showed that both Agrobacterium rhizogenes and peanut varieties significantly affected the induction rate of hairy roots. Huayu 45 had the highest induction rate of 93.7%， and its appropriate strain was A4. The hairy roots induction rate of Huayu 20 was 89.2%， and the suitable strain was ATCC15834. The hairy roots induction rate of Luhua 11 was 73.4%， and its fitting strain was GIM1.141.

Keywords Agrobacterium rhizogenes； Hairy roots； Induction rate； Peanut varieties

發(fā)根是整個(gè)植株或植株的某一器官、組織（包括愈傷組織）單個(gè)細(xì)胞甚至原生質(zhì)體受發(fā)根農(nóng)桿菌的感染所產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象[1]。發(fā)根農(nóng)桿菌能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，并在感染部位產(chǎn)生大量生長(zhǎng)迅速、多分支的發(fā)根[2]。發(fā)根的誘導(dǎo)是發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上T-DNA基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并表達(dá)的結(jié)果[3]。發(fā)根起源于單個(gè)細(xì)胞，具有生長(zhǎng)迅速、遺傳穩(wěn)定、有利于篩選高效表達(dá)克隆等特點(diǎn)[4]。發(fā)根轉(zhuǎn)化體系的建立與發(fā)根農(nóng)桿菌菌株有關(guān)，不同農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒對(duì)不同植物、同一植物不同部位以及同一植物同一部位不同發(fā)育階段的外植體有不同的敏感性；植物本身的基因型以及植物細(xì)胞受傷后的生理反應(yīng)、細(xì)胞激素水平以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)等因素也和發(fā)根轉(zhuǎn)化體系的建立有很大關(guān)系[5，6]。發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)是基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)[7]。

常用的發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)花生外植體發(fā)根誘導(dǎo)能力存在差異，近年來(lái)有關(guān)花生發(fā)根的研究不少[8-14]，但不同發(fā)根農(nóng)桿菌和花生基因型的組合并不多。本試驗(yàn)研究發(fā)根農(nóng)桿菌菌株和花生品種對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)率的影響，尋找菌株與品種的最佳組合，建立高效的發(fā)根轉(zhuǎn)化體系，從而獲得大量可在無(wú)激素培養(yǎng)基上旺盛生長(zhǎng)且遺傳穩(wěn)定的發(fā)根，以期為建立花生發(fā)根培養(yǎng)北方根結(jié)線蟲(chóng)體系提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生品種：花育20、花育45、魯花11，均由山東省花生研究所保存。

發(fā)根農(nóng)桿菌：GIM1.141、ATCC15834、A4，其中GIM1.141購(gòu)自廣東微生物菌種保存中心，ATCC15834、A4均由陜西理工學(xué)院保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定指標(biāo) 采用3×3雙因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因子1為發(fā)根農(nóng)桿菌菌株：GIM1.141、ATCC15834和A4；因子2為花生品種：花育20、花育45和魯花11；每個(gè)處理30個(gè)外植體，重復(fù)3次。發(fā)根誘導(dǎo)率=產(chǎn)生發(fā)根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.2.2 無(wú)菌苗的獲得 分別將3個(gè)花生品種的種子在70%乙醇中浸泡1 min，用無(wú)菌水清洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min消毒，再用無(wú)菌水沖洗4～5次，每次4～5 min，之后接種在1/2MS0培養(yǎng)基上，于25℃、12 h光周期條件培養(yǎng)， 6～8 d后長(zhǎng)出無(wú)菌苗。

1.2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的活化與培養(yǎng) 將超低溫（-80℃）保存的3株發(fā)根農(nóng)桿菌分別劃線接種于含100 mg/L卡那霉素（Kan）的YEB固體培養(yǎng)基上，于28℃暗處培養(yǎng)，至長(zhǎng)出單菌落。挑取平板上單菌落于10 mL含100 mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中， 28℃、黑暗下200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)約18 h，搖勻，取0.1 mL活化的菌液加入50 mL 含100 mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行二次活化，培養(yǎng)至農(nóng)桿菌液A600值達(dá)到0.5～0.8，將菌液3 000 r/min離心3 min后棄上清，用50 mL MS0液體培養(yǎng)基懸浮，即獲得侵染菌液。

1.2.4 外植體的轉(zhuǎn)化及發(fā)根的誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)上，將花生無(wú)菌苗的子葉切成0.3～0.5 cm小塊，并在外植體表面輕劃幾處傷口，置于侵染菌液中浸泡10～15 min后取出，倒掉菌液，用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，接種于MS0培養(yǎng)基上，于黑暗條件下培養(yǎng)2 d，后轉(zhuǎn)接到5MS0培養(yǎng)基〔含500 mg/L頭孢霉素（Cephalosporin，簡(jiǎn)寫(xiě)Cel）〕上培養(yǎng)3～5 d，再轉(zhuǎn)至3MS0抑菌培養(yǎng)基（含300 mg/L Cel）上培養(yǎng)。每7～8 d轉(zhuǎn)接1次，30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)發(fā)根數(shù)并計(jì)算發(fā)根誘導(dǎo)率。

1.2.5 除菌篩選培養(yǎng) 將生長(zhǎng)粗壯、約5～6 cm長(zhǎng)的發(fā)根切下，放入篩選培養(yǎng)基（含30 mg/L Kan+300 mg/L Cel）中，7～8 d后選正常生長(zhǎng)的根放入1MS0培養(yǎng)基（含100 mg/L Cel）上，每7～8 d轉(zhuǎn)接1次，繼代3次后轉(zhuǎn)接至MS0培養(yǎng)基（不含抗生素）中培養(yǎng)。篩選生長(zhǎng)快、長(zhǎng)勢(shì)好的發(fā)根，取該發(fā)根進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。

1.2.6 繼代培養(yǎng) 待篩選出的發(fā)根培養(yǎng)20～30 d出現(xiàn)老化現(xiàn)象時(shí)，將長(zhǎng)勢(shì)較好、未出現(xiàn)老化的末端發(fā)根剪下，每段大于3 cm，轉(zhuǎn)入新的MS0培養(yǎng)基（不含抗生素）中。

1.2.7 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的判斷 根據(jù)3項(xiàng)重要生物學(xué)特性初步判斷Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化情況：發(fā)根的發(fā)生多在母體植物的不定部位，發(fā)根表現(xiàn)為較弱的向地性，發(fā)根在無(wú)激素的培養(yǎng)基上能夠正?？焖俚厣L(zhǎng)[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.05對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)花生子葉的誘導(dǎo)培養(yǎng)

試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)品種花生子葉經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后，微小的愈傷組織出現(xiàn)在子葉切口處，7～9 d后從切口處產(chǎn)生發(fā)根（圖1A），發(fā)根多發(fā)生在母體植物的不定部位。3株發(fā)根農(nóng)桿菌菌株均可誘導(dǎo)花育20、花育45、魯花11的品種子葉外植體產(chǎn)生發(fā)根。發(fā)根切下后可在MS0培養(yǎng)基（不含抗生素）上獨(dú)立生長(zhǎng)（圖1B），表現(xiàn)為較弱的向地性。15～20 d后發(fā)根布滿整個(gè)培養(yǎng)皿（圖1C），在無(wú)激素的培養(yǎng)基上能夠正?？焖俚厣L(zhǎng)。從形態(tài)角度初步判斷發(fā)根Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株和花生品種對(duì)發(fā)根誘導(dǎo)率的影響

從表1可知，發(fā)根農(nóng)桿菌菌株和花生品種都顯著影響發(fā)根誘導(dǎo)率。不同花生品種平均發(fā)根誘導(dǎo)率為：花育45>花育20>魯花11。3株發(fā)根農(nóng)桿菌菌株在花育45平均發(fā)根誘導(dǎo)率為85.5%，花育20為82.4%，魯花11為57.1%，花育45的平均發(fā)根誘導(dǎo)率是魯花11的1.5倍；不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株平均發(fā)根誘導(dǎo)率為：A4>GIM1.141>ATCC15834。GIM1.141菌株在3個(gè)花生品種的平均發(fā)根誘導(dǎo)率為76.7%，A4為77.1%，ATCC15834為71.2%，A4菌株的平均發(fā)根誘導(dǎo)率是ATCC15834的1.08倍；可見(jiàn)，花生品種影響發(fā)根誘導(dǎo)率的作用要高于發(fā)根農(nóng)桿菌菌株的作用。同時(shí)花生品種和發(fā)根農(nóng)桿菌存在顯著交互作用。花育45的適宜發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為A4，發(fā)根誘導(dǎo)率為93.7%；花育20的適宜發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為ATCC15834，發(fā)根誘導(dǎo)率為89.2%；魯花11的適宜發(fā)根農(nóng)桿菌菌株為GIM1.141，發(fā)根誘導(dǎo)率為73.4%。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)利用不同發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化不同花生品種子葉外植體，均獲得了激素自主、多分支、多根毛、在無(wú)激素的MS0培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)的發(fā)根，且誘導(dǎo)率相對(duì)較高。在鑒別方法上，可以從形態(tài)學(xué)角度判斷發(fā)根[16]。試驗(yàn)所用的3株發(fā)根農(nóng)桿菌菌株均屬農(nóng)桿堿型，T-DNA具有不連續(xù)性，有兩個(gè)邊界區(qū)域，即TL-DNA和TR-DNA。TL-DNA上存在與根的形態(tài)有關(guān)的基因[17]。TR-DNA上有生長(zhǎng)素合成基因tms1和tms2，指導(dǎo)吲哚-3-乙酸（IAA）的合成，因此轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的發(fā)根在培養(yǎng)時(shí)不需要添加外源生長(zhǎng)素，為激素自養(yǎng)型[18]。當(dāng)T-DNA整合到植物基因組中，產(chǎn)生對(duì)生長(zhǎng)素敏感度比普通根強(qiáng)100～1 000倍的負(fù)向地性的發(fā)根[19]。本試驗(yàn)獲得的發(fā)根為激素自養(yǎng)型，且表現(xiàn)明顯負(fù)向地性，說(shuō)明T-DNA成功整合到植物基因組中。

研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率受到菌株種類(lèi)、寄主植物種類(lèi)和培養(yǎng)條件的影響，特別是植物基因型是公認(rèn)的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要限制因素[20]，說(shuō)明品種的選擇是建立高效發(fā)根誘導(dǎo)體系和培養(yǎng)體系的關(guān)鍵因素，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。發(fā)根農(nóng)桿菌菌株影響花生發(fā)根誘導(dǎo)率，可能是由于發(fā)根農(nóng)桿菌的致根特性與其所帶Ri質(zhì)粒的類(lèi)型有關(guān)[21]。花育45、花育20和魯花11的最適宜發(fā)根農(nóng)桿菌菌株分別為A4、ATCC15834和GIM1.141。以上結(jié)果可為建立花生發(fā)根培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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