苑學(xué)霞 蘇梅 鄔元娟 王文博 張從超 李瑞菊 李鴛鴦

摘要：為調(diào)查山東省生牛乳中金黃色葡萄球菌的耐藥性情況，本研究采集山東省6個(gè)不同地區(qū)的130份生牛乳樣品，進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離、鑒定及耐藥表型分析。結(jié)果表明，共有57份樣品判定檢出金黃色葡萄球菌，平均檢出率為43.85%。對(duì)57份樣品進(jìn)行8大類12種抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)青霉素的耐藥率最高，為87.72%，同時(shí)對(duì)氨芐西林、紅霉素和克林霉素的耐藥率也達(dá)到較高水平，分別為84.21%、78.95%和56.14%。另外，57株金黃色葡萄球菌中有50株為多重耐藥菌株，其中以耐3種藥物與耐5種藥物的菌株數(shù)最多，且耐藥譜種類較多，受地區(qū)差異影響較大。該結(jié)果可為山東地區(qū)奶牛業(yè)規(guī)范使用抗生素提供一定參考。

關(guān)鍵詞：生牛乳；金黃色葡萄球菌；耐藥性

中圖分類號(hào)：S823.9+1：R155.5+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）03-0117-04

Abstract In order to investigate the drug resistance of Staphylococcus aureus in raw cow milk， 130 samples of raw milk from 6 different areas of Shandong Province were collected for the isolation， identification and phenotypic analysis of S. aureus. The results showed that S. aureus were detected in 57 samples， and the average detection rate was 43.85%. The susceptibility test of 57 samples to 12 kinds of antibiotics belonged to 8 classes showed that the resistance rate to penicillin was the highest of 87.72%， and the resistance rates to ampicillin， erythromycin and clindamycin reached higher level， which were 84.21%， 78.95% and 56.14% respectively. In addition， 50 strains showed multiple drug resistance， and the strains resistant to three and five drugs were the most，and the drug multi-resistant patterns were various and different from areas. The results could provide references for the standard use of antibiotics in dairy industry in Shandong Province.

Keywords Raw cow milk； Staphylococcus aureus； Drug resistance

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是當(dāng)今世界三大食源性致病菌種之一，在空氣、土壤、健康的動(dòng)物和人及其糞便中廣泛存在[1]。金黃色葡萄球菌在適當(dāng)條件下，能夠產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒。如果長(zhǎng)期食用含有抗生素殘留的牛乳或乳制品，相當(dāng)于長(zhǎng)期低劑量的攝入抗生素，會(huì)使人體腸道內(nèi)的正常菌群受到抑制，從而引起致病菌大量繁殖使得局部或全身感染[2]。金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原菌[3]，抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥性金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)并泛濫[4]，重要的是其耐藥性還可通過(guò)食物鏈傳播[5]，這樣便增加了多重耐藥的危險(xiǎn)，同時(shí)對(duì)人類健康造成直接威脅。

本研究從山東部分地區(qū)各大奶牛場(chǎng)采集130份生牛乳樣品，利用生化方法與API試條同時(shí)鑒定樣品中的金黃色葡萄球菌，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，以期為選擇有效抗菌藥，防止抗生素的濫用及研究致病菌提供可靠依據(jù)，為完善奶牛養(yǎng)殖業(yè)致病菌防治體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品來(lái)源

金黃色葡萄球菌參考株ATCC29213，來(lái)自中國(guó)菌種保藏中心，用于耐藥性試驗(yàn)質(zhì)量控制。130份生牛乳樣品采自山東部分地區(qū)的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)收購(gòu)站和生鮮乳運(yùn)輸車。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基和主要試劑

7.5%氯化鈉肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、金黃色葡萄球菌生化鑒定試劑盒，均購(gòu)自環(huán)凱（廣東）微生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基，購(gòu)自科馬嘉（法國(guó)）微生物科技有限公司；藥敏試驗(yàn)所用藥物購(gòu)自天津金章科技發(fā)展有限公司。

1.3 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

參照《GB 4789.10—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》方法[6]。用一次性無(wú)菌吸管或者大號(hào)移液槍吸取25 mL乳樣，同時(shí)取225 mL無(wú)菌7.5%氯化鈉肉湯，兩者加入到均質(zhì)袋中。將均質(zhì)袋放入均質(zhì)器上拍打1 min左右后，用移液槍吸取1 mL混合樣品加入到金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基中，涂布均勻，放入生化培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)18 h，并設(shè)計(jì)空白對(duì)照。挑取顯色平板中紅色或粉紅色、生長(zhǎng)良好的單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，放入生化培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)18 h。挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中菌落接種于血平板中，同時(shí)進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，血平板中菌落呈金黃色或白色、周圍可見完整透明溶血圈，血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，且鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌的結(jié)果判定為金黃色葡萄球菌；同時(shí)用API試條顯色，結(jié)果經(jīng)API LAB Plus 系統(tǒng)鑒定，確定是否為金黃色葡萄球菌。

1.4 耐藥性檢測(cè)

采用微量肉湯稀釋法，試驗(yàn)方法及結(jié)果判定按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）M31-A3進(jìn)行[7]。對(duì)12種抗生素（頭孢噻呋、苯唑西林、氨芐西林、青霉素、紅霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、萬(wàn)古霉素、替米考星、克林霉素）進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的分離鑒定

在血平板中有60份樣品疑似為金黃色葡萄球菌，之后利用生化與API試條共同鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有57份樣品判定為金黃色葡萄球菌（表1）。API系統(tǒng)判定結(jié)果與生化鑒定結(jié)果一致。130份生鮮乳中，金黃色葡萄球菌的平均檢出率為43.85%，運(yùn)輸車與收購(gòu)站的檢出率沒(méi)有顯著差別。

2.2 金黃色葡萄球菌的耐藥率及耐藥表型譜

2.2.1 金黃色葡萄球菌對(duì)12種抗生素的耐藥率 表2顯示，金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥率最高，為87.72%，對(duì)氨芐西林、紅霉素和克林霉素的耐藥率也達(dá)到較高水平，分別為84.21%、78.95%和56.14%，對(duì)頭孢噻呋耐藥率最低，為1.75%。其中，值得注意的是有7株金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林耐藥，由對(duì)苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌引起的感染已成為臨床上較為棘手的問(wèn)題[8]。

2.2.2 57株金黃色葡萄球菌的耐藥表型譜 對(duì)3種或3種以上抗生素耐藥的菌株判定為多重耐藥菌株。本試驗(yàn)共有50株金黃色葡萄球菌具有多重耐藥性（表3），其中以耐3種藥物與耐5種藥物的菌株數(shù)量最高，且耐藥譜種類較多，受地區(qū)間差異影響較大。耐5種藥物中的AMP-EM-PEN-TIL-CLI藥譜菌株數(shù)量最多，共有8株。

3 討論與結(jié)論

本研究從山東部分地區(qū)采集的130份生鮮牛乳樣品，共分離到金黃色葡萄球菌57 株，平均檢出率為43.85%，高于已有報(bào)道（重慶市24.67%[9]、內(nèi)蒙古16.50%[10]）。這可能與當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖環(huán)境、衛(wèi)生防疫、獸醫(yī)獸藥管理、采奶環(huán)境及日常飼養(yǎng)管理技術(shù)有關(guān)。

對(duì)8大類共12種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明山東部分地區(qū)生鮮乳中分離的金黃色葡萄球菌具有非常嚴(yán)重的耐藥性，其中對(duì)青霉素的耐藥率最高，為87.72%，對(duì)氨芐西林、紅霉素和克林霉素的耐藥率也達(dá)到較高水平，分別為84.21%、78.95%和56.14%。另外，57株金黃色葡萄球菌中有50株為多重耐藥菌株，采集樣品的6個(gè)地區(qū)均存在極高的多重耐藥性現(xiàn)象，JA4地區(qū)多重耐藥性為100%。整體而言，57株金黃色葡萄球菌共獲得25種耐藥表型譜，耐藥譜廣，主要是β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、四環(huán)素、氨基糖苷類、紅霉素類等多種不同類型抗生素，其中耐5種藥物中的AMP-EM-PEN-TIL-CLI藥譜菌株數(shù)量最多。建議各養(yǎng)殖場(chǎng)暫停使用耐藥率高的抗生素，根據(jù)耐藥性結(jié)果適時(shí)調(diào)整抗生素使用方案，有針對(duì)性的選用藥物。

總之，不同地區(qū)來(lái)源的菌株對(duì)抗生素的耐藥趨勢(shì)基本相同，但耐藥種類差異明顯。這是由于地區(qū)管理不同，養(yǎng)殖行業(yè)使用抗生素劑量超標(biāo)和過(guò)于頻繁所致[11]。多重耐藥不僅增加了奶牛乳房炎的治療難度和成本，也給牛奶消費(fèi)者帶來(lái)食品安全隱患，應(yīng)引起奶牛養(yǎng)殖業(yè)和相關(guān)部門的高度重視。

參 考 文 獻(xiàn)：

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