張小紅 ，劉 季 ，李 娜 ，杜秋香 ，王英元 ，孫俊紅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.鄒平縣公安局，山東 鄒平 256200；3.廣州市公安局交通警察支隊(duì)，廣東 廣州 510000）

損傷時(shí)間推斷是法醫(yī)病理學(xué)研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)之一，損傷時(shí)間的研究雖然取得了很多成果[1-3]，但在實(shí)踐中應(yīng)用較有限，探索理想指標(biāo)仍是目前研究的主要任務(wù)。骨骼肌損傷在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中很常見(jiàn)，而氧化應(yīng)激信號(hào)通路是機(jī)體損傷后的重要保護(hù)機(jī)制之一，因此，本研究選擇骨骼肌和氧化應(yīng)激信號(hào)通路進(jìn)行觀察。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是氧化應(yīng)激信號(hào)通路中的一種關(guān)鍵蛋白。正常狀態(tài)下，其在胞質(zhì)中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）結(jié)合，活性被抑制。當(dāng)炎癥、輻射等有害刺激引起細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累時(shí)，引起Nrf2與Keap1解離，游離的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)蓄積，與抗氧化元件（antioxidant responsive element，ARE）結(jié)合，誘導(dǎo)解毒酶及抗氧化蛋白高表達(dá)，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。

研究[4-5]表明，氧化應(yīng)激信號(hào)通路在多種細(xì)胞的損傷與修復(fù)過(guò)程中起重要作用，作為該通路的關(guān)鍵信號(hào)分子ROS和Nrf2在肌肉損傷后的變化規(guī)律、機(jī)制及是否能夠用于損傷時(shí)間推斷有待于進(jìn)一步研究。心臟毒素（cardiotoxin，CTX）制作骨骼肌損傷模型具有損傷程度和范圍易于控制的優(yōu)點(diǎn)[6-7]，目前被廣泛用于骨骼肌損傷修復(fù)研究。因此，本研究采用大鼠腓腸肌內(nèi)注射CTX造模，觀察骨骼肌修復(fù)過(guò)程中組織形態(tài)學(xué)變化，探索氧化應(yīng)激信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Nrf2及重要因子ROS的表達(dá)變化規(guī)律，以期找到理想的損傷時(shí)間推斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

心臟毒素（cardiotoxin，CTX，ZX0005）購(gòu)自廣州威佳科技有限公司，2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’，7’-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFHDA，35845）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗大鼠Nrf2抗體（sc-722）、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-驢抗兔抗體（sc-2090）購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司，哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑（AR0101）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（AR0146）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液 5×（AR1112）、彩色預(yù)染蛋白 marker（10000～170000）、5%牛血清白蛋白封閉液（bovine serum albumin，BSA，AR0004）、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）底物（AR1170）、硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC）、4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6’-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（AR1176）、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 抗 體 （BA2913）、 辣 根 過(guò) 氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-羊抗兔 IgG（BA1054）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），2-16PK型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），電泳轉(zhuǎn)印兩用儀（美國(guó)C.B.S集團(tuán)有限公司），BioSpectrum凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司），RM2135型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BX61型熒光顯微鏡、BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及損傷模型制備

健康成年雄性SD大鼠84只，10～12周齡，體質(zhì)量220～250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，光照12 h/d，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷后1 h、4 h、8 h、12 h、16 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、13 d、17 d、21 d組，共14組，每組6只。

損傷后大鼠用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，剪去毛發(fā)，用75%乙醇溶液消毒后，于大鼠左下肢腓腸肌內(nèi)注射45μL CTX，建模成功后與正常對(duì)照組一起常規(guī)飼養(yǎng)。

在各損傷時(shí)間脫頸處死大鼠，迅速切取左下肢腓腸肌組織：部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色及免疫熒光染色；部分用液氮速凍后于-80℃低溫保存，用于ROS含量檢測(cè)及Western印跡法檢測(cè)。

正常對(duì)照組大鼠不做處理，處死方法、取材部位及實(shí)驗(yàn)方法同損傷組。

1.3 HE染色

取損傷區(qū)肌肉用4%多聚甲醛溶液固定24h后，脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋，制作4μm切片。切片經(jīng)脫蠟、水化后，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，在BH-2型光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 ROS相對(duì)含量檢測(cè)

取各組肌肉組織，稱重后用液氮低溫研磨，按肌肉質(zhì)量（g）∶PBS 體積（mL）＝1∶4 的比例加入 PBS，充分振蕩后，4℃下，1000×g離心10min，提取上清液。 用BCA法測(cè)定所提取各組上清液蛋白濃度并將各組上清液稀釋至相同濃度。取190μL上清液及10μL DCFH-DA（0.1μmol）在熒光酶標(biāo)板中混勻，37℃反應(yīng)30min。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的二氯熒光素（dichlorofluorescein，DCF），用酶標(biāo)儀測(cè)量DCF的熒光值，即為組織中ROS相對(duì)含量。

1.5 蛋白樣品制備及Western印跡法檢測(cè)

取低溫保存的各組肌組織，稱重后用液氮低溫研磨，按肌肉質(zhì)量（g）∶哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑體積（mL）＝1∶4的比例充分振蕩混勻，4℃下反應(yīng)90min，1000×g離心 10min，提取上清液。 用 BCA 法測(cè)定各組上清液蛋白濃度并稀釋至同一蛋白濃度，按4∶1的體積比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液5×，100℃煮沸5min。制作電泳凝膠，上樣、電泳，170mA轉(zhuǎn)印50 min，5%BSA封閉2 h，將NC膜上目的蛋白區(qū)和內(nèi)參蛋白區(qū)剪開(kāi)，分別滴加一抗（1∶200兔抗大鼠Nrf2抗體、1∶5 000兔抗大鼠GAPDH抗體）4℃孵育過(guò)夜，再分別滴加二抗（1∶2000 HRP-羊抗兔 IgG）室溫孵育2h，與ECL底物反應(yīng)，用BioSpectrum凝膠成像系統(tǒng)拍照、測(cè)量。

1.6 免疫熒光染色

取1.3節(jié)所述切片經(jīng)脫蠟、水化后，進(jìn)行免疫熒光染色：0.3%TritonX-100透膜，枸櫞酸微波修復(fù)，5%BSA封閉液封閉，滴加1∶200兔抗大鼠Nrf2抗體4℃孵育過(guò)夜，水洗后滴加1∶200 FITC-驢抗兔抗體室溫避光孵育1h，滴加DAPI染色液室溫孵育10min染核、抗熒光衰減劑封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。使用熒光顯微鏡拍照后，利用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組Nrf2陽(yáng)性核率（Nrf2陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)），以表示Nrf2蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用 SPSS 16.0、Image-Pro Plus 6.0、BioSpectrum凝膠成像系統(tǒng)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Nrf2陽(yáng)性核率用百分率表示，進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；ROS相對(duì)含量及Western印跡法檢測(cè)數(shù)據(jù)用±s表示，采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程的形態(tài)學(xué)變化

行HE染色觀察，在損傷后4 h即可看到骨骼肌細(xì)胞明顯水腫、壞死，有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，在損傷后16h中性粒細(xì)胞明顯增多，1d達(dá)高峰。損傷后3d炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以單核細(xì)胞為主，并伴有新生毛細(xì)血管及較多的成纖維細(xì)胞。損傷后5d可見(jiàn)大量核位于胞質(zhì)中央的新生肌細(xì)胞出現(xiàn)，13d時(shí)大量新生肌細(xì)胞融合為肌管，至21d時(shí)肌細(xì)胞分化成熟，細(xì)胞橫徑基本接近正常肌細(xì)胞，核位于細(xì)胞膜下（圖1）。

2.2 大鼠骨骼肌損傷后ROS相對(duì)含量變化

與正常對(duì)照組相比，骨骼肌損傷后ROS相對(duì)含量在損傷后12h減少（P＜0.05），其余各組變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 大鼠骨骼肌損傷后Nrf2蛋白表達(dá)變化

用Western印跡法檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常對(duì)照組相比，骨骼肌組織僅損傷后16h表達(dá)升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組Nrf2蛋白變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 大鼠骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中的病理學(xué)改變 HE×200

表1 大鼠骨骼肌損傷后ROS相對(duì)含量及Nrf2 陽(yáng)性核率 （n=6，±s）

表1 大鼠骨骼肌損傷后ROS相對(duì)含量及Nrf2 陽(yáng)性核率 （n=6，±s）

注：1）與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 ROS相對(duì)含量 Nrf2陽(yáng)性核率/%正常對(duì)照 1.00±0.00 13.46±0.01損傷后 1h 0.83±0.31 23.99±0.061）損傷后 4h 0.77±0.20 20.93±0.041）2）損傷后 8h 0.75±0.22 22.79±0.061）損傷后 12h 0.74±0.371） 25.95±0.161）2）損傷后 16h 0.86±0.23 31.46±0.041）2）損傷后 1d 0.95±0.14 33.36±0.081）損傷后 3d 1.00±0.07 30.59±0.061）2）損傷后 5d 1.03±0.19 29.19±0.101）損傷后 7d 1.10±0.12 25.05±0.081）2）損傷后 9d 1.19±0.33 21.37±0.101）2）損傷后 13d 1.12±0.17 16.28±0.071）2）損傷后 17d 0.98±0.15 14.06±0.03損傷后 21d 0.99±0.18 13.91±0.11

圖2 骨骼肌損傷后不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2蛋白表達(dá)量

2.4 Nrf2蛋白在骨骼肌損傷后陽(yáng)性核率比較

對(duì)各組骨骼肌組織進(jìn)行免疫熒光染色，Nrf2蛋白呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，當(dāng)綠色熒光與藍(lán)色熒光重疊表示Nrf2蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。由圖3可見(jiàn)，在骨骼肌損傷后Nrf2蛋白染色陽(yáng)性的細(xì)胞核比正常對(duì)照組增多，并隨損傷時(shí)間呈先增高后減少的變化。

對(duì)各組骨骼肌Nrf2陽(yáng)性核率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表1），與正常對(duì)照組相比，在骨骼肌損傷后除17d、21d外，其余時(shí)間點(diǎn)Nrf2陽(yáng)性核率均升高（P＜0.05）；各損傷組與相鄰上組比較，除4h與8h、16h與1d、3d與5d、13 d與17 d、17 d與21 d 5組外，其余各相臨兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且Nrf2陽(yáng)性核率呈先增高后降低的變化規(guī)律，在16h～1d達(dá)到峰值。

圖3 骨骼肌免疫熒光染色 ×400

3 討 論

氧化應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的代謝活動(dòng)起重要調(diào)節(jié)作用，參與組織細(xì)胞抗氧化、炎癥、衰老及凋亡等病理生理過(guò)程，此通路包含一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子ROS[4-5，8-13]。HORIE等[8]用電刺激小鼠C2C12細(xì)胞，刺激停止后，增加的ROS在1h內(nèi)迅速降至對(duì)照水平；有研究者[9]用·NO（活性氧）刺激HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2從停止刺激后4h開(kāi)始升高，24h升高到131%，說(shuō)明ROS代謝迅速，但短時(shí)間內(nèi)增多可誘導(dǎo)Nrf2蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位。但信號(hào)分子ROS在損傷后是否持續(xù)處于高水平以維持細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白水平以及損傷后Nrf2蛋白的核轉(zhuǎn)位機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，信號(hào)分子ROS和組織中Nrf2蛋白在損傷1h后與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Nrf2陽(yáng)性核率顯著增高，說(shuō)明氧化應(yīng)激信號(hào)通路在修復(fù)過(guò)程中被激活，而ROS僅在損傷早期（1h內(nèi)）起“開(kāi)關(guān)樣”激活作用，Nrf2并不是通過(guò)蛋白表達(dá)增多，而是通過(guò)Nrf2蛋白的核轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)對(duì)其下游代謝的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一方面也表明，在肌肉損傷1h后檢測(cè)信號(hào)分子ROS的含量變化對(duì)損傷時(shí)間推斷應(yīng)用價(jià)值不大。

文獻(xiàn)[5，11，14-17]報(bào)道，Nrf2 蛋白具有抗感染、促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞分化和增殖、抑制衰老等作用。結(jié)合HE染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白高表達(dá)正處于炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化階段，隨肌細(xì)胞成熟而恢復(fù)到對(duì)照水平，說(shuō)明Nrf2參與了骨骼肌損傷后的炎癥反應(yīng)、肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化及成熟的過(guò)程，具有促進(jìn)損傷修復(fù)的作用。

Nrf2陽(yáng)性核率在損傷后1 h～13 d均高于正常對(duì)照組，在16h～1d達(dá)峰值，在17d降至對(duì)照水平，具有隨損傷時(shí)間先升后降的時(shí)序性變化規(guī)律。HE染色顯示，在損傷1 d內(nèi)主要表現(xiàn)為壞死及炎癥反應(yīng)，3 d后主要是組織修復(fù)，因此，可將Nrf2陽(yáng)性核率變化與HE染色相結(jié)合，用于損傷時(shí)間推斷。當(dāng)然使用此指標(biāo)仍具有推斷時(shí)間跨度大的局限性，后續(xù)研究可以尋找其他mRNA及蛋白指標(biāo)結(jié)合應(yīng)用來(lái)縮短損傷時(shí)間推斷的時(shí)間窗并提高準(zhǔn)確性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌損傷后，氧化應(yīng)激信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Nrf2陽(yáng)性核率隨骨骼肌的損傷修復(fù)過(guò)程呈時(shí)序性變化，說(shuō)明其參與此過(guò)程，并且其變化規(guī)律可用于骨骼肌損傷時(shí)間推斷。

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