劉耘汀 ，孫大明 ，施少培 ，楊 旭

（1.華東政法大學(xué)，上海 200043；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

對嫌疑人現(xiàn)場留下的蛛絲馬跡進行識別和追蹤是刑事案件偵破的最常用手段之一。隨著嫌疑人反偵察意識的增強，傳統(tǒng)的鑒定方法如手印、足跡等痕跡鑒定已無法完全滿足現(xiàn)代刑事偵查的要求。毛發(fā)、血液、軟組織碎片等生物物證的DNA分析技術(shù)是近年來使用廣泛、成熟可靠的物證鑒定技術(shù)，被廣泛運用于犯罪現(xiàn)場、犯罪嫌疑人、血緣關(guān)系確認等諸多偵查領(lǐng)域[1-2]，但該技術(shù)對生物檢材的質(zhì)和量均有一定要求，部分限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

細菌作為最原始、種類數(shù)量最龐大的客體，是人體與生俱來的附屬生物。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，細菌幾乎存在于人體所有部位并和人體建立了密切的共生或寄生關(guān)系，一個正常人所攜帶的細菌約為1.0～1.5kg，這些細菌大多存在于腸道系統(tǒng)，幫助人體消化食物、保護病原微生物入侵。僅就人手部而言，每個人雙手大約有150種細菌，總數(shù)多達80萬個。2010年，F(xiàn)IERER等[5-6]發(fā)現(xiàn)，細菌寄生人體具有一定的“特異性”，即每個人可能具有獨有的寄生細菌，人和人之間的菌群種類差別高達80%～90%，且在人體手部接觸物體后，留在物體表面的細菌可存活2周，這些細菌具有頑強的生命力，即使在犯罪嫌疑人用洗滌液清洗后，殘留的少量細菌仍能在4h左右恢復(fù)原有細菌菌群。因此，人體自身特有的細菌群落，可能成為犯罪現(xiàn)場無法消除的重要生物學(xué)線索。當提取到犯罪嫌疑人殘留在其接觸物體上的細菌后，即可擴大培養(yǎng)，進而復(fù)原細菌原有種群，通過DNA指紋技術(shù)建立獨特的“細菌指紋圖譜”，從而用于司法鑒定工作。

DNA指紋技術(shù)是指利用不同生物體中DNA序列的差異性，建立起的一種用于個體識別、遺傳追溯的DNA條帶圖譜。該技術(shù)自從20世紀70年代被提出后，迅速運用于物種起源進化、腫瘤發(fā)生、疾病診斷、親子鑒定、法醫(yī)鑒定等諸多領(lǐng)域[7-8]。腸道細菌基因間重復(fù)序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）是最早在腸道細菌中發(fā)現(xiàn)的長度約為124～127bp的高度保守的DNA重復(fù)序列。近年大量研究[9-13]表明，幾乎所有細菌基因組均包括ERIC，該序列在不同細菌基因組的重復(fù)頻次、間隔等具有特異性。在使用該序列的PCR引物進行擴增后，腸道中不同的細菌會出現(xiàn)特異性DNA條帶圖譜，即ERICPCR指紋圖譜。這種圖譜具有分辨率高、敏感性高、重復(fù)性高、操作簡便快速等特點，因此被越來越多地運用于細菌鑒定、種群分布、群落生態(tài)等研究領(lǐng)域。

本研究采集人體示指細菌和其常用手機觸摸屏、個人辦公桌桌面細菌，對菌群進行擴大培養(yǎng)后，提取混合細菌的宏基因組DNA，利用ERIC-PCR技術(shù)對上述樣本分別進行分型，通過對三者之間的圖譜比對分析，探討ERIC-PCR指紋圖譜用于同一認定的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

酵母浸粉、胰蛋白胨（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），溶菌酶、飽和酚溶液、蛋白酶K（國藥集團化學(xué)試劑上海有限公司），ERIC-PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］，LA Taq 酶、dNTP、DNA maker（日本TaKaRa公司），9700型PCR儀（美國AB公司），G-Box型凝膠成像分析儀（美國SYNGENE公司），PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-Rad公司），5810R型低溫冷凍離心機（德國eppendorf公司），NanoDrop 2000C分光光度計（美國Thermo Scientific公司），SIMF140AY65型雪花狀制冰機（日本SANYO公司）。

1.2 實驗材料

1.2.1 細菌樣本采集及培養(yǎng)

邀請男性和女性志愿者各5名，用滅菌PBS溶液濕潤滅菌棉球，根據(jù)志愿者使用手機和鼠標的習(xí)慣，分別擦拭志愿者右手示指、手機觸摸屏、個人辦公桌桌面，將擦拭后的棉球放入標識好的普通培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。男性細菌樣本用M代表，示指分別編號為Mf1～5，對應(yīng)的手機觸摸屏分別編號為Mp1～5，對應(yīng)的桌面編號為Me1～5；女性樣本用F代表，示指、手機觸摸屏、個人辦公桌桌面分別編號為Ff1～5、Fp1～5、Fe1～5。LB培養(yǎng)基配方如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉15g/L，高滅菌后倒置固體平板培養(yǎng)基。

1.2.2 細菌宏基因組提取

取過夜培養(yǎng)16h的菌液3mL，以離心半徑10cm，5000r/min，離心10min，棄上清液，PBS緩沖液洗菌體沉淀3次，1mL PBS重懸后加入50mg/mL溶菌酶37℃孵育1h，依次加入100μL 10%SDS溶液，20 mg/mL蛋白酶K 55℃孵育1h，再加入1500μL 5mol/L NaCl溶液；最后經(jīng)過 V酚∶V氯仿∶V異戊=25∶24∶1 抽提，2 倍體積無水乙醇沉淀DNA后雙蒸水溶解。

1.2.3 ERIC-PCR

ERIC-PCR 引物序列為 ERIC（F） 5′-ATGTAAG CTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC（R） 3′-AAGTAAGTG ACTGGGGTGAGCG-5′[8，11]。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94℃ 3s，92℃ 30s，50℃ 1min，65℃ 8min；30 次循環(huán)；65℃ 8 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，由G-Box型凝膠成像分析儀采集圖像。

1.3 結(jié)果分析

電泳圖譜通過G-Box型凝膠成像分析儀采集條帶后進行分析比對。

2 結(jié) 果

2.1 示指宏基因組DNA質(zhì)量

如圖1所示，所有采集到的志愿者宏基因組均有較完整的全基因組條帶。另外，經(jīng)NanoDrop 2000C分光光度計分析，所有DNA的D260/280值均在1.8～2.0。

圖1 10名志愿者的宏基因組DNA提取結(jié)果

2.2 示指和手機觸摸屏細菌宏基因組ERIC-PCR關(guān)聯(lián)性比較

示指和手機觸摸屏細菌宏基因組ERIC-PCR結(jié)果如圖2所示，在10名志愿者中一共有4名男性、3名女性的示指與手機觸摸屏上的菌群ERIC-PCR指紋圖譜對應(yīng)吻合。有1名男性、2名女性示指和手機觸摸屏上的細菌ERIC-PCR指紋圖譜不一致，其中1名男性（7～8泳道）示指和手機觸摸屏上的DNA圖譜只有一條近似大小的DNA條帶，1名女性（11～12泳道）示指和手機觸摸屏上的菌群ERIC-PCR指紋圖譜完全不同，無同樣大小的條帶。以上兩名志愿者示指和手機觸摸屏上的菌群采集和ERIC-PCR重復(fù)三次，結(jié)果完全相同。對于不同人的ERIC-PCR指紋圖譜進行比對發(fā)現(xiàn)，不論是示指還是手機觸摸屏上的細菌ERIC-PCR指紋圖譜均有較大區(qū)別。

圖2 示指和手機觸摸屏菌群宏基因組ERIC-PCR結(jié)果

2.3 示指和個人辦公桌桌面細菌宏基因組ERICPCR關(guān)聯(lián)性比較

如圖3，在10名志愿者中，只有2名男性（1～2和9～10泳道）和1名女性（17～18泳道）的示指與個人辦公桌桌面菌群ERIC-PCR指紋圖譜對應(yīng)吻合，而其他7名志愿者示指和辦公桌桌面菌群ERIC-PCR指紋圖譜不完全相符。但圖譜條帶比對分析發(fā)現(xiàn)，3～4、5～6、11～12、13～14、15～16、19～20 泳道中至少有一個條帶大小近似，且大多數(shù)條帶大小完全一致，可以根據(jù)條帶的符合程度來推測兩者之間細菌種群的近似性，條帶位置、數(shù)目越接近，表示兩者的菌群構(gòu)成越相似。

圖3 示指和辦公桌桌面細菌宏基因組ERIC-PCR結(jié)果

3 討 論

2010年，F(xiàn)IERER等[5]發(fā)現(xiàn)細菌寄生人體具有一定的“特異性”。2012年，GOGA 研究[14]發(fā)現(xiàn)，可以通過襪子上的細菌來確定襪子的所有者。以上研究證明，細菌作為一種可擴增繁殖、不易被消除的生物材料，在法醫(yī)學(xué)鑒定方面具有較大潛力，但實際運用并不多。

本研究通過對志愿者示指和接觸物（手機觸摸屏、個人辦公桌桌面）細菌進行ERIC-PCR，建立DNA指紋圖譜，比較示指和其接觸物（手機觸摸屏、個人辦公桌桌面）之間細菌宏基因組的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人體示指與接觸物（手機觸摸屏、個人辦公桌桌面）菌群之間存在關(guān)聯(lián)性，且這種關(guān)聯(lián)性可以借助ERIC-PCR建立DNA指紋圖譜來快捷、直觀地呈現(xiàn)。其中，與手機觸摸屏相比，個人辦公桌桌面采集的細菌和個體示指表面菌群的關(guān)聯(lián)性明顯降低?？紤]到示指及接觸物（手機觸摸屏、個人辦公桌桌面）菌群復(fù)雜，部分細菌可能帶有莢膜、細胞壁等，對細菌的裂解造成影響，另外糖類、蛋白質(zhì)、RNA可能也會對擴增結(jié)果產(chǎn)生不良影響，而相較于一般PCR，ERIC-PCR對模板DNA要求更高。因此，為了保證DNA質(zhì)量，本實驗采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop 2000C分光光度計測定D260/280值兩種方法來檢測DNA質(zhì)量。另外，反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)細菌樣品的采集極為關(guān)鍵，物品使用者的個人習(xí)慣、環(huán)境中其他微生物等都會對ERIC-PCR結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

因為本研究招募的志愿者人數(shù)有限，所得的結(jié)果只能作為初步推測。鑒于細菌群落構(gòu)成受地域、性別、年齡、職業(yè)、遺傳等多個因素影響而表現(xiàn)出相對的穩(wěn)定和變化，手機觸摸屏、個人辦公桌桌面的菌群也受到濕度、酸堿度、時間等因素影響，為了盡可能地避免干擾，實驗邀請的10名志愿者均為年齡、職業(yè)、工作環(huán)境相對一致的研究生，但最終想要將菌群作為個體識別的材料之一，仍需進一步深入研究。此外，本研究雖然通過ERIC-PCR指紋圖譜比對方法初步證明了宏基因組在同一認定中的應(yīng)用價值，但是由于體外培養(yǎng)的方法可能帶來微生物種類的變化或偏移，加之檢驗方法的靈敏度所限，在今后的研究中將對實驗方法進一步優(yōu)化，包括采用新一代高通量測序等更加靈敏的檢測手段以及增加樣本檢測量和代表性，使研究結(jié)果更接近鑒定應(yīng)用的需要。

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