白超博，佡劍非

帕金森病（Parkinson disease，PD）是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢步態(tài)異常等。當(dāng)臨床癥狀出現(xiàn)時，黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)己有50%～70%的多巴胺能神經(jīng)元缺失[1]。PD主要發(fā)病年齡為40～70歲，發(fā)病率隨年齡增長而增加[2]。PD的主要病理變化包括多巴胺能神經(jīng)元變性，Lewy體形成和紋狀體多巴胺減少等[3]。PD的病因包括遺傳易感性、環(huán)境毒素的作用和衰老，其發(fā)病可能是多種因素的共同作用。PD的治療方案多為對癥治療，包括補充左旋多巴，多巴胺激動劑和MAOB抑制劑等，但這只能緩解癥狀，并不能阻斷或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)生與發(fā)展。

Hoehn-Yahr分級表是用來紀(jì)錄帕金森癥病情的分級表[4]。分級從0期～5期，用于評估患者的殘障級別?；蛐酒遣捎酶咄糠椒▉慝@取生物信息的一種技術(shù)，可用來分析疾病與正常組織之間的差異基因，進(jìn)一步分析為可為臨床研究提供新的線索[5，6]。本研究利用來自基因芯片公共數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus（GEO）的一組Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者外周血的基因芯片進(jìn)行研究，分析差異基因及核心基因涉及的生物學(xué)過程及細(xì)胞通路，有助于進(jìn)一步闡明Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO[7]，材料為未經(jīng)過治療的Hoehn-Yahr分級為1期PD患者的外周血漿RNA測序數(shù)據(jù)。采用的實驗平臺是Illumina公司GPL10558芯片的8個樣本。GEO登陸號GSM1318547-GSM1318550為Hoehn-Yahr分級為1期PD患者外周血的數(shù)據(jù)；登陸號GSM1318552-GSM1318555為健康對照組外周血數(shù)據(jù)[8]。

1.2 方法

1.2.1 分析軟件本實驗使用的GEO2R是基于R語言，GEO數(shù)據(jù)庫自帶的差異基因在線分析軟件。DAVID（Database for annotation，visualization and integrated discovery 6.8）為在線基因功能注釋分析工具（https：//david.ncifcrf.gov/），STRING（Functional proteinassociation networks 10.0）為在線蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析工具（http：//www.string-db.org/）。CytoScape 3.4是一款圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件。

1.2.2 分析方法差異表達(dá)基因分析采用GEO數(shù)據(jù)庫的GEO2R在線分析工具進(jìn)行差異表達(dá)基因分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。本研究中多重假設(shè)檢驗控制采用Benjamini和Hochberg提出的假陽性率控制法[9]。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05，基因表達(dá)值倍數(shù)變化（log FC）的絕對值＞1。

將差異基因?qū)朐诰€分析軟件DAVID中，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析和KEGG通路分析。對這些基因進(jìn)行生物學(xué)解釋，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

再將上調(diào)的差異基因?qū)朐诰€分析軟件STRING中，對差異基因所編碼的蛋白進(jìn)行相互作用分析，互作評分combination score＞0.4為存在互作的閾值條件。篩選掉與其他基因編碼的蛋白孤立的點，最終形成蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。將STRING所得的蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape軟件，利用CytoScape篩選核心基因[10-12]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的GO富集分析和通路分析

利用GEO2R差異基因在線分析軟件從Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者外周血的基因芯片GSE54536數(shù)據(jù)集中共篩選出997個差異基因，其中上調(diào)的差異基因有606個，下調(diào)的差異基因有391個。

通過對差異基因的DAVID富集分析，上調(diào)的基因主要涉及形態(tài)發(fā)生時的解剖結(jié)構(gòu)形成過程、動作電位、肌肉系統(tǒng)的運動過程、大腦的發(fā)育、細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)、多細(xì)胞生物信號傳遞、心血管系統(tǒng)的發(fā)育等生物學(xué)過程。分子功能表明，上調(diào)的差異基因主要涉及SAMD蛋白的結(jié)合及核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性。下調(diào)的基因主要涉及B細(xì)胞受體信號通路、負(fù)趨化性過程、發(fā)育過程中涉及的凋亡過程、細(xì)胞分泌、核苷酸磷酸化等生物學(xué)過程。還涉及到細(xì)胞膜、免疫球蛋白復(fù)合物、軸突部分及蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)等的組成。分子功能表明，下調(diào)的差異基因主要涉及蛋白復(fù)合物的形成。排在前10位的差異基因的DAVID分析結(jié)果見表1。

通過對差異基因的KEGG分析，上調(diào)的基因主要涉及蛋白多糖在癌癥中的作用通路和膽堿能突觸通路。下調(diào)的基因主要涉及原發(fā)性免疫缺陷通路，造血細(xì)胞系通路，腸道免疫網(wǎng)絡(luò)的IgA的產(chǎn)生通路，PI3KAkt信號傳導(dǎo)通路，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路，細(xì)胞因子受體相互作用通路。差異基因KEGG分析結(jié)果見表2。

2.2 差異表達(dá)基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將上調(diào)的差異基因?qū)朐诰€分析軟件STRING中，除去孤立無互作的蛋白節(jié)點，篩選出501個上調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系。再把STRING所得的蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape軟件，以節(jié)點的邊Degree＞10為標(biāo)準(zhǔn)篩選中心節(jié)點，選取排在前10位的核心基因，見表3。

3 討論

PD是一種進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要原因是多巴胺能神經(jīng)元變性導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。隨著基因組及蛋白質(zhì)組技術(shù)的成熟及廣泛應(yīng)用，大量PD相關(guān)的基因被報道并證實[13]。通過對這些信息的再研究，可以進(jìn)一步探索PD的發(fā)病機制。目前對于PD的研究大多數(shù)為疾病中晚期或正在接受治療的患者，然而這些研究結(jié)果不能代表疾病初始階段的病理機制。但是對PD患者在癥狀發(fā)生前進(jìn)行腦部內(nèi)在病理過程的研究幾乎不可能，因此引起PD的具體病理機制至今尚不清楚。

本研究通過對Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者外周血基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，希望在轉(zhuǎn)錄水平研究PD的發(fā)病機制，提示PD為多種基因，多種分子機制相互作用的結(jié)果，對于PD早期的病理機制的闡明具有重要意義。

通過對差異基因的篩選及分析，筆者發(fā)現(xiàn)差異基因主要涉及形態(tài)發(fā)生時的解剖結(jié)構(gòu)形成過程，動作電位，肌肉系統(tǒng)的運動過程，大腦的發(fā)育，細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，多細(xì)胞生物信號傳遞，心血管系統(tǒng)的發(fā)育等生物學(xué)過程。B細(xì)胞受體信號通路，負(fù)趨化性過程，發(fā)育過程中涉及的凋亡過程，細(xì)胞分泌，核苷酸磷酸化等生物學(xué)過程。還涉及到細(xì)胞膜，免疫球蛋白復(fù)合物，軸突部分以及蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)等的組成。分子功能表明，差異基因主要涉及蛋白復(fù)合物的形成，SAMD蛋白的結(jié)合以及核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性。通過KEGG發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及蛋白多糖在癌癥中的作用通路和膽堿能突觸通路，原發(fā)性免疫缺陷通路，造血細(xì)胞系通路，腸道免疫網(wǎng)絡(luò)的IgA的產(chǎn)生通路，PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路，細(xì)胞因子受體相互作用通路。這些結(jié)果與其他一些通過生物信息學(xué)方法研究PD的文章具有很大的聯(lián)系[14-16]。提示可以從外周血中的差異基因的分子功能和通路去研究PD患者潛在的發(fā)病機制。

表1 差異基因的富集分析

表2 差異基因所涉及的生物學(xué)通路

表3 Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者外周血基因差異表達(dá)分析上調(diào)核心蛋白

核心基因c-fos屬于早期反應(yīng)基因，可以對細(xì)胞外的信號產(chǎn)生興奮性反應(yīng)，F(xiàn)os是c-fos的蛋白產(chǎn)物。在基底核區(qū)刺激多巴胺受體可誘導(dǎo)Fos的表達(dá)。因為多巴胺D1及D2受體分別表達(dá)在直接通路的紋狀體黑質(zhì)神經(jīng)元和間接通路的紋狀體蒼白球神經(jīng)元上，所以Fos的表達(dá)可以反映直接通路和間接通路的活動[17]。c-fos基因與PD的發(fā)病具有密切聯(lián)系。核心基因KDM6B又名Jmjd3，在PD的免疫學(xué)發(fā)病機制中，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞表型的表觀遺傳調(diào)控中起著重要作用。經(jīng)典激活（M1表型）和替代激活（M2型）是小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的兩極，可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利或有益的影響。研究表明，JMJD3可以通過修改組蛋白H3K27me3提高M(jìn)2型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，因此它在小膠質(zhì)細(xì)胞表型的開關(guān)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能有助于研究PD的免疫發(fā)病機制[18]。核心基因ESR1與PD的易感性密切相關(guān)。Gao等[19]通過meta分析相關(guān)的病例對照研究，發(fā)現(xiàn)VDR、ESR1和ESR2的基因多態(tài)性與PD的易感性密切相關(guān)，VDR、ESR1和ESR2的基因多態(tài)性可以增加PD的發(fā)病率。

其他核心基因大多數(shù)與腫瘤有密切聯(lián)系。CCND1與乳腺癌有關(guān)，miR-520a-3p可以通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制CCND1和CD44的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，miR-520a-3p可能成為未來治療乳腺癌的靶點之一[20]。Egr-1基因在絕大多數(shù)的腫瘤中均有表達(dá)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過放射治療后可以誘導(dǎo)Egr-1基因表達(dá)，同時引起其下游基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡，放射治療后的Egr-1基因表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[21]。TCF7L2作為2型糖尿病的易感基因，以及IL8基因，都與乳腺癌的發(fā)病也存在一定聯(lián)系。MAPK-7與骨肉瘤有密切聯(lián)系[22-24]。HDAC8與肝細(xì)胞性肝癌具有相關(guān)性[25]。這些核心基因與PD的關(guān)系，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)工具，分析了Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者外周血基因的變化情況。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，Hoehn-Yahr分級為1期的PD患者外周血基因表達(dá)變化模式存在明顯的差異，提示PD為多種基因，多種分子機制相互作用的結(jié)果。篩選得到的關(guān)鍵基因，如FOS、KDM6B、ESR1等，在PD的發(fā)病機制中可能起了重要作用，值得進(jìn)一步深入研究。對于PD早期外周血基因表達(dá)差異的研究，有助于進(jìn)一步揭示PD早期的病理過程，對疾病的早期診斷及治療具有重要意義。

[1] Fearnley JM，Lees AJ.Ageing and Parkinson's disease：substantia nigra regional selectivity[J].Brain，1991，114：2283-2301.

[2] N Yao，QY Xu.Pathology and impact of the locus ceruleus in Parkinson's disease[J].ActaAnatomica Sinica，2014，45：291-296.

[3] Braak H，Del Tredici K，Rüb U，et al.Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease[J].NeurobiolAging，2003，24：197-211.

[4] Hoehn MM，Yahr MD.Parkinsonism：onset，progression and mortality[J].Neurology，1967，17：427-442.

[5] Amid A，Nan Chik ND，Jamal P，et al.Microarray and quantitative PCR analysis of gene expression profiles in response to treatment with tomato leaf extract in mcf-7 breast cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13：6319-6325.

[6] Yang L，Tan J，O'Brien EJ，et al.Systems biology definition of the core proteome of metabolism and expression is consistent with high-throughput data[J].Proc NatlAcad Sci USA，2015，112：10810-10815.

[7] Barrett T，Nilhite SE，Ledoux P，et al.NCBI GEO：archive for functional genomics data sets--update[J].Nucleic Acids Res，2013，41：D991-995.

[8] Alieva AKh，Shadrina MI，F(xiàn)ilatova EV，et al.Involvement of endocytosis and alternative splicing in the formation of the pathological process in the early stages of Parkinson's disease[J].Biomed Res Int，2014，2014：718732.

[9] 劉晉，張濤，李康.多重假設(shè)檢驗中FDR的控制與估計方法[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2012，29：305-308.

[10] Szklarczyk D，F(xiàn)ranceschini A，Nyder S，et al.STRING v10：proteinprotein interaction networks，integrated over the tree of life[J].Nucleic Acids Res，2015，43：D447-452.

[11] Shannon P，Markiel A，Ozier O，et al.Cytoscape：a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J].Genome Res，2003，13：2498-2504.

[12] Bader GD，Hogue CN.An automated method for finding molecular complexes in large protein interaction networks[J].BMC Bioinformatics，2003，4：2.

[13] Dawson TM，Dawson VL.Molecular pathways of neurodegeneration in Parkinson's disease[J].Science，2003，302：819-822.

[14] Mandel S，Grunblatt E，Riederer P，et al.Gene expression profiling of sporadic Parkinson's disease substantia nigra pars compacta reveals impairment of ubiquitin-proteasome subunits，SKP1A，aldehyde dehydrogenase，and chaperone HSC-70[J].Ann N YAcad Sci，2005，1053：356-375.

[15] Ohnuki T，Nakamura A，Okuyama S，et al.Gene expression profiling in progressively MPTP-lesioned macaques reveals molecular pathways associated with sporadic Parkinson's disease[J].Brain Res，2010，1346：26-42.

[16] Grünblatt E，Mandel S，Jacob-Hirsch J，et al.Gene expression profiling of parkinsonian substantia nigra pars compacta；alterations in ubiquitinproteasome，heat shock protein，iron and oxidative stress regulated proteins，cell adhesion/cellular matrix and vesicle trafficking genes[J].J Neural Transm(Vienna)，2004，111：1543-1573.

[17] Saryyeva A，Nakamura M，Krauss JK，et al.c-Fos expression after deep brain stimulation of the pedunculopontine tegmental nucleus in the rat 6-hydroxydopamine Parkinson model[J].J Chem Neuroanat，2011，42：210-217.

[18] Tang Y，Li T，Li J，et al.Jmjd3 is essential for the epigenetic modulation of microglia phenotypes in the immune pathogenesis of Parkinson's disease[J].Cell Death Differ，2014，21：369-380.

[19] Gao Z，F(xiàn)u HJ，Xue JJ，et al.Genetic polymorphisms in VDR，ESR1 and ESR2 genes may contribute to susceptibility to Parkinson's disease：a meta-analysis[J].Mol Biol Rep，2014，41：4463-4474.

[20] Li J，Nei J，Mei Z，et al.Suppressing role of miR-520a-3p in breast cancer through CCND1 and CD44[J].Am J Transl Res，2017，9：146-154.

[21] 李洪佳，董廣璐.Egr-1基因與腫瘤及放射治療研究進(jìn)展[J].中華腫瘤防治雜志，2012，19：1753-1756.

[22] 劉桂紅.2型糖尿病易感基因TCF7L2、IGF2BP2多態(tài)性與漢族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)研究[D].河北醫(yī)科大學(xué)，2014.

[23] 李任增.MAPK7基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用研究[D].鄭州大學(xué)，2015.

[24] 方琦，趙春英，朱江，等.白介素-8基因表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2005，9：5-7.

[25] Tian Y，Nong VN，Nong GL，et al.Histone Deacetylase HDAC8 Promotes Insulin Resistance and β-Catenin Activation in NAFLD-Associated Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Res，2015，75：4803-4816.