吳玲，徐箐，李娣，姜德立，陳敏

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210029；2.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

鹽酸表柔比星屬于蒽環(huán)類抗生素，是一種高效、廣譜的抗腫瘤藥，主要應(yīng)用于乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌和非霍奇金淋巴瘤的治療，為同類藥物的首選［1－4］。然而，表柔比星治療腫瘤的最大缺點(diǎn)是藥物選擇性低，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)引起大量正常組織和細(xì)胞的死亡，產(chǎn)生一系列的毒副反應(yīng)，大大影響了治療效果和患者整體生存期。因此，提高表柔比星的生物利用度、降低其毒副反應(yīng)在臨床上顯得尤為重要［5－6］。采用磁性納米微球作為表柔比星的載體，可通過(guò)載體系統(tǒng)的靶向性實(shí)現(xiàn)選擇性給藥，從而有效提高藥物利用度，減少治療劑量，同時(shí)降低毒性。目前，磁性納米載體的合成及其對(duì)表柔比星載藥性能的影響，已成為表柔比星新劑型的研發(fā)熱點(diǎn)［7－8］。

磁性納米微球作為藥物載體有制備簡(jiǎn)單、成本低廉等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。但磁性納米微球具有較高的比表面積和磁偶極相互作用，具有強(qiáng)烈的聚集傾向，因此，常常要對(duì)其進(jìn)行表面修飾，形成磁性復(fù)合材料，以降低磁性納米微球的表面能并通過(guò)空阻或靜電斥力提高其分散性，從而達(dá)到更好的載藥效果。目前，磁性納米材料的表面修飾劑有多種，其中，SiO2以其突出的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注［9－10］。本研究制備SiO2包覆Fe3O4（SiO2＠Fe3O4）復(fù)合磁性納米微球，考察其對(duì)表柔比星的載藥性能和緩釋效果，旨在為靶向納米表柔比星藥物載體的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

注射用鹽酸表柔比星（浙江海正藥業(yè)有限公司），三氯化鐵（FeCl3）、乙酸鈉、乙二醇、無(wú)水乙醇、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、正硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用之前未經(jīng)過(guò)二次提純。

1.2　Fe3O4納米微球的制備

將1.5 g FeCl3、1 g PVP和2 g乙酸鈉加入 30 mL乙二醇中，攪拌3 h至完全溶解，倒入100 mL反應(yīng)釜，置于200℃烘箱，反應(yīng)8 h。將得到的黑色產(chǎn)物分別用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗凈，60℃烘干。

1.3　制備SiO2＠Fe3O4微球并測(cè)試試劑用量或比例對(duì)其形貌的影響

將0.1 g Fe3O4與一定比例的水和無(wú)水乙醇混合后，超聲15min，滴加TEOS與氨水的混合溶液，持續(xù)攪拌3 h，分離產(chǎn)物并將其分別用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，烘干后得到SiO2＠Fe3O4復(fù)合納米微球材料。

通過(guò)以下對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)試TEOS用量、氨水用量以及水和無(wú)水乙醇的比例對(duì)SiO2＠Fe3O4復(fù)合材料形貌的影響。

（1）調(diào)整 TEOS的用量分別為 0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL V（氨水）＝1.0 mL，V（水）：V（無(wú)水乙醇）＝1∶5，考察不同 TEOS用量對(duì) SiO2＠Fe3O4形貌的影響。

（2）調(diào)整氨水（28%，14.8 mol／L）的用量分別為 0.5，0.75，1.0，1.25和 1.5 mL，V（TEOS）＝0.8 mL，V（水）：V（無(wú)水乙醇）＝1∶5，考察氨水用量對(duì) SiO2＠Fe3O4納米微球形貌的影響。

（3）調(diào)整水和無(wú)水乙醇用量的比例（體積比）分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和 1∶8，V（TEOS）＝0.8 mL，V（氨水）＝1.25 mL，考察不同比例水和無(wú)水乙醇用量對(duì)SiO2＠Fe3O4納米微球形貌的影響。

1.4　藥物吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SiO2＠Fe3O4納米微球?qū)Ρ砣岜刃堑奈铰?/h3>

配制0.05 mg／mL的表柔比星溶液，分別稱取5，10，15，20，25，30，35和 40 mg的 Fe3O4＠SiO2，加入到10 mL已配好的表柔比星溶液中，磁力攪拌4 h，將反應(yīng)后的溶液經(jīng)離心后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在232 nm處測(cè)定離心液中表柔比星的濃度（C）。吸附率的計(jì)算公式如下：

1.5　藥物緩釋效果實(shí)驗(yàn)

將已吸附表柔比星的磁性微球放入10mL磷酸緩沖液中，測(cè)定溶液中的表柔比星濃度（C1），超聲5 min后，將樣品置于37℃氣浴恒溫振蕩器，振蕩速度為 100 r／min，分別于 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5以及4 h各取樣5 mL，并補(bǔ)充磷酸緩沖液到10 mL，測(cè)定溶液中表柔比星的濃度（C2）。按下列公式計(jì)算表柔比星釋藥率：

根據(jù)鹽酸表柔比星釋藥率的變化評(píng)價(jià)所制得SiO2＠Fe3O4復(fù)合納米微球的緩釋效果。

1.6　材料表征方法

采用XRD-6100型X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）測(cè)試產(chǎn)物 SiO2＠Fe3O4的純度和晶體結(jié)構(gòu)；通過(guò)JEM-2100型透射電子顯微鏡（transmission electronmicroscopy，TEM）測(cè)試產(chǎn)物的形貌和微觀結(jié)構(gòu)；采用Nicolet Nexus 470型傅立葉紅外光譜儀（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）測(cè)試樣品的特征吸收峰及表面基團(tuán)的變化，掃描范圍為4 000～400 cm－1；通過(guò)外加磁場(chǎng)的作用，考察制備的SiO2＠Fe3O4納米微球的磁響應(yīng)性；磁學(xué)性質(zhì)通過(guò)振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1　Fe3 O4納米微球的形貌和粒徑

TEM下，產(chǎn)物Fe3O4納米微球?yàn)榻蛐晤w粒，平均粒徑約為200 nm，粒度均勻性良好，無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。從球體邊緣細(xì)節(jié)處可見(jiàn)，所制備的Fe3O4為非單晶結(jié)構(gòu)，由很多小顆粒團(tuán)聚而成。見(jiàn)圖1。

圖1　Fe3 O4納米微球（透射電子顯微鏡）

2.2　SiO2＠Fe3O4納米微球的形貌分析

2.2.1不同TEOS用量對(duì)SiO2＠Fe3O4納米微球形貌的影響 TEM觀察結(jié)果顯示，SiO2膜的厚度隨著TEOS用量的增加而變厚（圖2），當(dāng) V（TEOS）＝0.8 mL時(shí)，形成的膜厚度適中而均勻（約60 nm），此后增加TEOS的用量，SiO2膜出現(xiàn)不均的現(xiàn)象。見(jiàn)圖2。以上現(xiàn)象的原因是SiO2膜的形成是TEOS水解與縮合的過(guò)程，保持其他條件不變，隨著TEOS用量的增加，水解速率增大，其聚合度也增大，生成的SiO2膜的厚度也就增大；當(dāng)TEOS用量過(guò)大時(shí)，由于水解速度過(guò)快，聚合度增加，Si-OH基團(tuán)還沒(méi)吸附到溶液中懸浮的Fe3O4納米微球的表面，就發(fā)生聚合，形成了SiO2顆粒。

2.2.2不同氨水用量的SiO2＠Fe3O4納米微球的形貌比較 如圖3所示，SiO2膜的厚度隨著氨水用量的增加而變厚，當(dāng) V（氨水）＝1.25 mL時(shí)，形成的膜厚度適中且均勻（約60 nm），繼續(xù)增加氨水的用量，SiO2膜的厚度基本保持不變。由于堿催化條件下的TEOS水解屬OH－離子直接與硅原子核反應(yīng)的親核取代反應(yīng)，在其他條件不變的情況下，隨著氨濃度的增大，溶液OH－濃度增大，促進(jìn)了TEOS的水解。且氨水用量增加時(shí)，體系中硅酸的縮合速率也隨之提高，當(dāng)大于水解速率時(shí)，所生成的SiO2膜也逐漸加厚。氨水用量超過(guò)1.25 mL時(shí)，SiO2膜的厚度基本保持不變，這是由于反應(yīng)體系中的TEOS已反應(yīng)完全。

圖2　不同TEOS用量時(shí)SiO2＠Fe3 O4納米微球（透射電子顯微鏡）

圖3　不同氨水用量時(shí)的SiO2＠Fe3O4納米微球（透射電子顯微鏡）

2.2.3水和無(wú)水乙醇用量比例對(duì)SiO2＠Fe3O4納米微球形貌的影響 TEM分析結(jié)果顯示，SiO2膜隨無(wú)水乙醇比例的增加而變厚，當(dāng) V（水）∶V（無(wú)水乙醇）＝1∶5時(shí)，形成的膜厚度適中而均勻（約60 nm）。此后加大比例，SiO2膜厚度不再出現(xiàn)明顯變化，且出現(xiàn)不均現(xiàn)象。見(jiàn)圖4。該反應(yīng)加入無(wú)水乙醇與水作為共溶劑，隨著加入的無(wú)水乙醇量的增加，TEOS在水中的溶解度也增大，促進(jìn)水解生成更多的SiO2。當(dāng)水和無(wú)水乙醇的比例超過(guò)1∶5時(shí)，SiO2膜的厚度不再發(fā)生明顯變化，這是由于反應(yīng)體系中的TEOS已完全水解。

綜上所述，當(dāng) V（TEOS）＝0.8 mL，V（氨水）＝1.25 mL，V（水）∶V（無(wú)水乙醇）＝1∶5時(shí)，SiO2在 Fe3O4表面包覆均勻完整，厚度約為60 nm。

圖4　不同水與無(wú)水乙醇比例時(shí)的SiO2＠Fe3 O4納米微球（透射電子顯微鏡）

2.3　Fe3O4＠SiO2納米微球的物相分析

XRD譜圖顯示，納米SiO2為無(wú)定形結(jié)構(gòu)，XRD特征衍射峰不明顯。Fe3O4微球位于2θ值為30.2°，35.7°，43.4°，53.4°，57.3°和 62.7°處的 6個(gè)特征衍射峰分別對(duì)應(yīng)于立方相 Fe3O4的（220），（311），（400），（422），（511）和（440）晶面，與 Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)JCPDS卡片（26－1136）一致。SiO2包覆于 Fe3O4表面形成SiO2＠Fe3O4復(fù)合材料后，F(xiàn)e3O4對(duì)X射線的衍射強(qiáng)度降低，使得復(fù)合材料的6個(gè)特征衍射峰強(qiáng)度較Fe3O4稍弱。見(jiàn)圖5。

圖5 SiO2、Fe3 O4和 SiO2＠Fe3 O4的 XRD譜圖

2.4　SiO2＠Fe3O4納米微球的紅外譜圖分析

FT-IR譜圖顯示，波數(shù)為3 441.90 cm－1處出現(xiàn)的寬吸收峰，對(duì)應(yīng)于-OH的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)；位于1 089 cm－1的強(qiáng)吸收峰，為Si-O-Si的振動(dòng)峰；波數(shù)為814 cm－1處的峰對(duì)應(yīng)于Si-O-Si鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)；在584 cm－1處出現(xiàn)了Fe3O4的Fe-O特征吸收峰。表明成功制備SiO2＠Fe3O4復(fù)合納米材料。見(jiàn)圖6。

2.5　SiO2＠Fe3O4的磁學(xué)性質(zhì)分析

振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)得的Fe3O4和SiO2＠Fe3O4磁滯回線曲線（圖7）顯示，室溫時(shí) Fe3O4和SiO2＠Fe3O4并無(wú)剩磁現(xiàn)象，矯頑力為零，表明所合成的樣品具有良好的超順磁性。

2.6　SiO2＠Fe3O4納米微球的體外磁響應(yīng)性

外加磁場(chǎng)后原本均勻分散在無(wú)水乙醇溶液中的SiO2＠Fe3O4納米微球在5 s內(nèi)迅速聚集在磁鐵一側(cè)，表明SiO2＠Fe3O4納米微球具有良好的磁響應(yīng)性。見(jiàn)圖8。

圖6　SiO2＠Fe3 O4納米微球的FT-IR譜圖

圖7　Fe3O4和SiO2＠Fe3O4的磁滯回線曲線

圖8　SiO2＠Fe3 O4納米微球被外磁場(chǎng)吸引

2.7　SiO2＠Fe3O4納米微球的藥物吸附能力

藥物吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0.05 mg／mL的表柔比星溶液中，SiO2＠Fe3O4納米微球?qū)Ρ砣岜刃堑奈搅侩S著SiO2＠Fe3O4納米微球用量的增加而增加；當(dāng) m（SiO2＠Fe3O4）＝25 mg時(shí)，達(dá)到最大吸附率（51.9%）；此后再增加 SiO2＠Fe3O4納米微球用量，吸附率基本保持不變。見(jiàn)圖9。

圖9　SiO2＠Fe3O4納米微球?qū)Ρ砣岜刃堑奈铰?/p>

2.8　SiO2＠Fe3 O4納米微球的藥物緩釋效果

從SiO2＠Fe3O4納米微球?qū)Ρ砣岜刃堑尼尫徘€（圖10）可看出，30 min內(nèi)表柔比星釋藥率即達(dá)14%，60 min后釋藥率達(dá)27.9%，120 min的釋藥率為36.2%，150 min后維持在40.5%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SiO2＠Fe3O4的藥物緩釋效果較好。

圖10　SiO 2＠Fe3 O4納米微球?qū)Ρ砣岜刃堑尼尫徘€

3 結(jié)論

本研究以水熱法制備的Fe3O4作為內(nèi)核，無(wú)水乙醇和水為共溶劑，28%氨水（14.8 mol／L）為催化劑，通過(guò)正硅酸四乙酯的水解與縮合，制備了SiO2＠Fe3O4復(fù)合納米微球；研究了不同條件下，SiO2＠Fe3O4復(fù)合納米微球的不同形貌，當(dāng) V（TEOS）＝0.8 mL，V（氨水）＝1.25 mL，V（水）∶V（無(wú)水乙醇）＝1∶5時(shí)，SiO2在Fe3O4表面包覆均勻完整，厚度約為60 nm。

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)考察SiO2＠Fe3O4復(fù)合納米微球的磁學(xué)性質(zhì)、其對(duì)表柔比星藥物的吸附和釋放實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了所制備納米微球的磁性、藥物吸附性能和緩釋效果。結(jié)果表明，SiO2＠Fe3O4藥物吸附率達(dá)51.9%，磁響應(yīng)性和緩釋效果均良好，可作為表柔比星藥物的靶向載體，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域都具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Waddell T，Chau I，Cunningham D，et al.Epirubicin，oxaliplatin，and capecitabine with or without panitumumab for patients with previously untreated advanced oesophagogastric cancer（REAL3）：a randomised，openlabel phase 3 trial［J］.Lancet Oncol，2013，14（6）：481－489.

［2］Iveson T，Donehower RC，Davidenko I，et al.Rilotumumab in combination with epirubicin，cisplatin，and capecitabine as first-line treatment for gastric or oesophagogastric junction adenocarcinoma：an open-label，dose de-escalation phase 1b study and a double-blind，randomised phase 2 study［J］.Lancet Oncol，2014，15（9）：1007－1018.

［3］Wang J，LiQ，LiX，etal.A novel FAPa-based Z-Gly-Pro epirubicin prodrug for improving tumor-targeting chemotherapy［J］.Eur JPharmacol，2017，815：166－172.

［4］Karunarathna U，Kongsema M，Zona S，et al.OTUB1 inhibits the ubiquitination and degradation of FOXM1 in breast cancer and epirubicin resistance［J］.Oncogene，2016，35（11）：1433－1444.

［5］Karimi F，Shojaei AF，Tabatabaeian K，et al.CoFe2O4nanoparticle／ionic liquidmodified carbon paste electrode as an amplified sensor for epirubicin analysis as an anticancer drug［J］.JMol Liq，2017，242：685－689.

［6］Sawyer MB，Pituskin E，Damaraju S，et al.A uridineglucuronosyltransferase 2B7 polymorphism predicts epirubicin clearance and outcomes in early-stage breast cancer［J］.Clin Breast Cancer，2016，16（2）：139－144.

［7］Gao J，Gu H，Xu B.Multifunctionalmagnetic nanoparticles：design，synthesis，and biomedical applications［J］.Acc Chem Res，2009，42（8）：1097－1107.

［8］Xu C，Sun S.Superparamagnetic nanoparticles as targeted probes for diagnostic and therapeutic applications［J］.Dalton Trans，2009（29）：5583－5591.

［9］Li A，Zhang J，Xu Y，et al.Thermoresponsive copolymer／SiO2nanoparticles with dual functions of thermally controlled drug release and simultaneous carrier decomposition［J］.Chemistry，2014，20（40）：12945－12953.

［10］Kebria MRS，Jahanshahi M，Rahimpour A.SiO2modified polyethyleneimine-based nanofiltration membranes for dye removal from aqueous and organic solutions［J］.Desalination，2015，367：255－264.