郭永龍 馮 穎 王建發(fā) 常玉巧 趙國安 郭志坤△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院， 1 河南省醫(yī)用組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2 第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 3 第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 新鄉(xiāng) 453000)

冠心病(coronary artery disease，CAD)是多因素相關(guān)疾病，全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)證實(shí)多個(gè)基因與冠心病存在相關(guān)性，特別是含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶7(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 7, ADAMTS7)基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[1-2]。ADAMTS7是金屬蛋白酶家族中的一員，含有信號(hào)肽序列、前體結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、解聚樣結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)和TSP-1重復(fù)基序。隨著原代培養(yǎng)細(xì)胞和ADAMTS7敲除小鼠的進(jìn)一步研究顯示：ADAMTS7可能通過降解胞外軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)使血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)遷移增強(qiáng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，提示ADAMTS7參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄過程[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)與冠心病相關(guān)的ADAMTS7的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)有rs3825807[5]、rs1994016[2]和rs4380028[6]。rs3825807(T-214C)位點(diǎn)多態(tài)性導(dǎo)致ADAMTS7前體結(jié)構(gòu)域中Ser214Pro的替換，使Furin蛋白對(duì)前體結(jié)構(gòu)域的加工效率下降，影響ADAMTS7蛋白成熟，導(dǎo)致其對(duì)COMP降解能力下降使VSMCs遷移能力下降。rs1994016位于ADAMTS7基因內(nèi)含子8中，rs4380028位于基因上游7.6Kb處，具體作用機(jī)制尚不清楚[3]。但是上述CAD相關(guān)ADAMTS7的SNPs研究主要集中在歐洲人群中，鑒于歐洲和亞洲人群的遺傳背景具有本質(zhì)區(qū)別, 這些關(guān)聯(lián)需要進(jìn)一步的重復(fù)性研究確認(rèn)。本研究旨在對(duì)河南地區(qū)漢族冠心病患者rs3825807和rs4380028位點(diǎn)多態(tài)性研究，明確其與冠心病易感性及病變嚴(yán)重程度的跨族裔關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年2～10月入住新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院心內(nèi)科，有1支或1支以上冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑狹窄超過50%的冠心病患者416例，同期冠狀動(dòng)脈造影或冠狀動(dòng)脈電子計(jì)算機(jī)斷層掃描成像(computed Tomography angiography，CTA)排除冠心病的健康體檢者270例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無血緣關(guān)系的河南地區(qū)漢族人口；(2)無嚴(yán)重肝腎疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)/減低癥、風(fēng)濕免疫疾病、心肌病和先天性心臟?。?3)冠心病組均符合以下標(biāo)準(zhǔn)；選擇性冠脈造影術(shù)或冠脈CTA顯示一支及以上血管內(nèi)徑狹窄超過50%；(4)對(duì)照組經(jīng)冠脈造影或者冠脈CTA等檢查排除冠心病的健康體檢者；(5)簽署冠脈造影知情同意書。

1.2 基因組DNA提取

收集冠心病組及對(duì)照組外周血5 ml，EDTA-K2抗凝處理后放入-80℃超低溫冰箱保存，DNA用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取自外周血基因組，用NanoDrop-2000進(jìn)行純度及濃度檢測，-80℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增和基因多態(tài)性分析

使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，rs3825807上游引物5′-CCC-TCCATGGACACAGTAC-3′，下游引物5′- CCCACA-CAGACTCACCATGT-3′，擴(kuò)增片段519 bp；rs4380028上游引物5′-GACATGGCC CATACCCTCTT-3′，下游引物5′-GCTTCTACTGCCTTTGAGCC-3＇，擴(kuò)增片段576 bp。PCR反應(yīng)體系50 μl，包括熱啟動(dòng)混合Taq酶25 μl，DNA模板5 μl，上下游引物各5 μl(終濃度0.2 μmol/μl)，去離子水加至50熱啟動(dòng)混合Taq酶25 μl，試劑均為大連寶生物公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min； 95℃變性30 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)； 72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)金唯智生物科技(北京)有限公司測序。

1.4 Gensini積分

Gensini積分用于評(píng)定患者冠狀動(dòng)脈病變狹窄程度，用Gensini標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法評(píng)定，以每一冠狀動(dòng)脈的狹窄基本評(píng)分乘以該病變部位的系數(shù)，即為該病變血管的評(píng)分，各病變血管得分總和即為患者的Gensini積分。Gensini評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)狹窄程度確定基本評(píng)分，狹窄直徑<25%，計(jì)1分；≥25%～<50%，計(jì)2分；≥50%～<75%，計(jì)4分；≥75%～<90%，計(jì)8分；≥90%～<99%，計(jì)16分；99%～100%，計(jì)32分；(2)根據(jù)不同冠脈分支確定相應(yīng)系數(shù)，左主干病變×5；左前降支病變：近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1；對(duì)角支病變：D1×1，D2×0.5；左回旋支病變：近段×2.5，鈍緣支×1，遠(yuǎn)段×1，后降支×1，后側(cè)支×0.5；右冠狀動(dòng)脈病變：近、中、遠(yuǎn)和后降支均×1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 主要危險(xiǎn)因素及頸動(dòng)脈斑塊情況

冠心病組和對(duì)照組的年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，冠心病組的吸煙率高于對(duì)照組，冠心病組的糖尿病、高血壓病和高脂血癥伴發(fā)率也高于對(duì)照組(P<0.05)。冠心病組的血甘油三酯和低密度脂蛋白高于對(duì)照組，高密度脂蛋白低于對(duì)照組(P<0.05)，冠心病組和對(duì)照組的總膽固醇差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。冠心病組的頸動(dòng)脈斑塊厚度、個(gè)數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析

在冠心病組和正常對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析, rs3825807(P=0.12)、rs4380028(P=0.15)均符合Hardy-Weinberg平衡，表示抽取樣本群體具有代表性。

表1 冠心病組和正常對(duì)照組臨床資料比較Tab 1 Clinical data in CAD group and control group

2.3 SNPs與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性

河南地區(qū)漢族人rs3825807的基因型為CC、TC和TT，等位基因?yàn)镃或T；rs4380028的基因型為AA、GG、AG，等位基因A或G。以冠心病作為因變量，位點(diǎn)基因型、SNPs等位基因、性別、年齡、高血壓、吸煙等因素為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析的結(jié)果顯示：rs3825807中T等位基因是C等位基因患CAD風(fēng)險(xiǎn)的1.92倍(95%CI=1.37-2.69，P<0.01)，含T等位基因型TC、TT分別是攜帶CC基因型患CAD風(fēng)險(xiǎn)的5.65倍和5.00倍(95%CI=1.93-16.51，PTC<0.03；95%CI=2.14-11.66，PTT<0.01)； rs4380028中AG、GG與AA基因型、G等位基因與A等位基因間CAD患病風(fēng)險(xiǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表2 冠心病組和對(duì)照組ADAMTS7 SNPs基因型和等位基因頻率分布Tab 2 Genotypic and allelic frequencies of the ADAMTS7 in two groups

2.4 SNPs與冠心病病變程度的關(guān)聯(lián)性

冠心病患者SNPs與Gensini積分、頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊厚度和個(gè)數(shù)進(jìn)行單因素分析結(jié)果顯示：Gensini積分在rs3825807中TT>TC型(P<0.05)，TC型與CC型的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Gensini積分>100者僅在TT基因型中顯示；頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊厚度TT>TC>CC(P<0.05)，頸動(dòng)脈斑塊個(gè)數(shù)在3種基因型間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Gensini積分和頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊厚度在rs4380028中AA、AG和GG基因型間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，頸動(dòng)脈斑塊個(gè)數(shù)GG>AA(P<0.05)(圖1)。頸動(dòng)脈超聲圖2A-2C顯示在rs3825807中頸動(dòng)脈斑塊厚度TT>TC>CC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；圖2D-2F顯示在rs4380028中頸動(dòng)脈斑塊厚度GG、AG、AA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

3 討論

ADAMTS7廣泛的表達(dá)于心、血管、軟骨等部位，目前發(fā)現(xiàn)的作用底物：COMP、α2-MG和PGRN[7]，其中COMP生理狀態(tài)高度表達(dá)于VSMCs等細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中[8]，血管外基質(zhì)中的COMP和α7β1整合素相互作用以維持血管平滑肌的穩(wěn)定性和收縮性，ADAMTS7降解COMP促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移[9-10]，并且ADAMTS自身具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生理修復(fù)作用[11]，兩者共同促進(jìn)內(nèi)膜增厚和斑塊形成從而加重冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[12]。最近對(duì)動(dòng)物心特異性COMP敲除的研究中顯示心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)凋亡，凋亡的原因可能由于胞外基質(zhì)中COMP和整合素β1連接保護(hù)作用被抑制所致[13]。也有相關(guān)研究表明冠心病的發(fā)病過程中氧化應(yīng)激和慢性炎癥產(chǎn)生TNF-α、H2O2、白細(xì)胞介素-1等可以上調(diào)ADAMTS7的蛋白表達(dá)水平[14]，并且冠心病患者血漿中ADAMTS7水平明顯高于對(duì)照組，與心功能程度對(duì)應(yīng)[15-16]，提示ADAMTS7不僅參與了冠心病的起始階段，也很有可能參與了冠心病遠(yuǎn)期心功能改變的過程。

圖1 ADAMTS7基因多態(tài)性和冠心病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)Fig 1 The relationship between ADAMTS7 gene polymorphism and the severity of coronary artery disease

圖2 冠心病患者ADAMTS7不同基因頸動(dòng)脈斑塊超聲圖Fig 2 Carotid artery ultrasonography of ADAMTS7 gene in patients with coronary artery disease

本研究以冠心病患者為研究對(duì)象，結(jié)合性別、年齡等危險(xiǎn)因素(對(duì)照組人群TC和H-LDL高于冠心病組，可能原因是診斷后服用降脂藥物的結(jié)果)對(duì)SNPs與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，顯示冠心病組和對(duì)照組rs3825807位點(diǎn)CC、TC、TT和T等位基因間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是CAD的風(fēng)險(xiǎn)基因位點(diǎn)，而冠心病組與對(duì)照組rs4380028的AA、GG、AG和G等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs4380028基因多態(tài)性對(duì)冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)的影響可能較小，因而rs3825807的等位基因T是冠心病的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。鑒于頸動(dòng)脈斑塊形成和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化屬于動(dòng)脈粥樣硬化的不同部位表現(xiàn)，且常將頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和斑塊形成作為判斷動(dòng)脈粥樣硬化的指標(biāo)，并且測定直觀方便。本研究分析rs3825807、rs4380028與冠心病病變程度關(guān)系時(shí)，選用了Gensini評(píng)分、動(dòng)脈內(nèi)膜增厚和斑塊個(gè)數(shù)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[17]，結(jié)果顯示rs3825807位點(diǎn)等位基因T可能影響內(nèi)膜厚度。

綜上所述，本研究證明了ADAMTS7基因多態(tài)性對(duì)漢族人冠心病的影響是跨族裔存在的，這種關(guān)聯(lián)主要集中rs3825807位點(diǎn)；本研究中等位基因T頻率為88.5%，與歐洲相關(guān)研究中的52%存在明顯種族差異[1]。從易感性、病變程度和心功能等方面分析得出rs3825807等位基因T不僅增加了冠心病的易感性，還主要通過降解COMP促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜增厚增加冠心病的嚴(yán)重程度。ADAMTS7基因多態(tài)性是否通過調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心功能產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。在這個(gè)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究將有助于動(dòng)脈粥樣硬化患者從ADAMTS7的SNPs個(gè)性化診療中受益，這些患者血漿中COMP或ADAMTS7檢測也可能提供動(dòng)脈粥樣硬化病變嚴(yán)重程度或進(jìn)展的信息。