高靈愛,包燁華,張永生,楚佳梅

(1.余杭區(qū)第五人民醫(yī)院，浙江 杭州 311100；2.杭州市中醫(yī)院，浙江 杭州 310007；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310007)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD) 是威脅人類健康的主要疾病之一，并隨著人類壽命的延長，發(fā)病率呈明顯增高趨勢，患者通常在發(fā)病后數(shù)年內(nèi)死亡。現(xiàn)代研究證明，阿爾茨海默病的病理始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)是β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)的沉積[1]。β-淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是由Aβ經(jīng)過β、γ分泌酶依次裂解產(chǎn)生[2-3]。APP表達(dá)增加被認(rèn)為是AD的風(fēng)險因素之一?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，β-APP與AD的發(fā)生有密切關(guān)系[4]，有研究報道[5]APP可能在抑制AD的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其在通過LRPI調(diào)節(jié)腦中apoE代謝及建立APP與apoE之間的生物聯(lián)系中APP的γ分泌酶切割發(fā)揮著核心作用。APP能夠通過促進(jìn)神經(jīng)生長因子產(chǎn)生從而促進(jìn)軸突生長。APP可以促進(jìn)突出形成、生長和牽引；APP具有誘導(dǎo)和維持長時程記憶的作用[6]。Stokin等[7]指出過量表達(dá)的APP會導(dǎo)致神經(jīng)元軸突功能損害，且這種損害與Aβ的產(chǎn)生無關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)“治未病”思想為指導(dǎo)，擬“補(bǔ)腎養(yǎng)心”為治則，利用麥粒灸未病先防、防病傳變及無毒副作用的特點(diǎn)，早期介入麥粒灸治療APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察淀粉樣前體蛋白表達(dá)，從而抑制β淀粉樣蛋白的沉積，進(jìn)一步影響老年斑的形成，最終預(yù)防老年癡呆的發(fā)生。

1　材料與方法

1.1　動物與分組

由上海生命科學(xué)院景乃禾研究員惠贈的1.5月齡的B6SJL-Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J品系、雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠雜合體種鼠4只，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心及上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[SCXK(滬)2007-0005]配種鼠；以上所用鼠均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF級轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動物中心飼養(yǎng)保種并繁衍產(chǎn)生后代，用PCR實(shí)驗(yàn)方法在子鼠出生后3～4周齡時進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。

依據(jù)符合科技部相關(guān)善待實(shí)驗(yàn)動物的倫理學(xué)規(guī)定處置實(shí)驗(yàn)過程中動物。按隨機(jī)數(shù)字表將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性雌性小鼠17只隨機(jī)分為兩組，一組9只為模型組，另一組8只為治療組，9只同齡同背景的C57BL/6J陰性雌性小鼠為正常對照組。

1.2　主要試劑及儀器

一抗：兔抗APP(批號bs-0112R，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供)；二抗：鼠抗兔IgG(批號SP-9001，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供)；濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9032,批號60882801，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)；PTC-200 PCR 擴(kuò)增儀(由Biorad 公司提供)；艾絨：艾灸王(直徑18 mm×200 mm，中國漢醫(yī)艾絨)。

1.3　動物模型基因鑒定方法

用PCR實(shí)驗(yàn)方法鑒定APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)過程，取3周齡子代小鼠鼠尾約0.5 cm入離心管內(nèi)→加裂解液→56℃轉(zhuǎn)動過夜→離心后異丙醇混勻→離心沉淀DNA→瓊脂糖凝膠電泳檢DNA片段→讀取跑膠結(jié)果：Tg(APP):轉(zhuǎn)基因377 bp和野生型324 bp;Tg(PS1):轉(zhuǎn)基因608 bp和野生型324 bp。結(jié)果見圖1。

圖1　電泳結(jié)果　　注：M為Marker，其中，1、2、5、6、7、9、11、13、14、17、19、21、22、24、26、28、29為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠

檢測出29只雌性子代小鼠取PCR產(chǎn)物長度為Tg(APP) 377 bp和Tg(PS1)608 bp的17只雙轉(zhuǎn)基因陽性雌性小鼠為本實(shí)驗(yàn)研究對象，隨機(jī)分為兩組分別為9只模型組和8只治療組。

1.4　治療方法

本實(shí)驗(yàn)開始之前剔除AD小鼠穴位區(qū)域的毛發(fā)，參照中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸分會制定《動物針灸穴位圖譜》、比較解剖學(xué)的方法為本實(shí)驗(yàn)小鼠取“心俞”“腎俞”穴。采取人工固定小鼠的方法，分別給實(shí)驗(yàn)組小鼠施行操作，具體方法如下：模型組予抓取固定等刺激和正常組不做任何處理；治療組予提前備好麥粒大小圓錐形艾炷(直徑5 mm×高8 mm)放置“心俞”“腎俞”穴，待艾炷燃燒至3/5時鑷子即去除，每次每穴灸一壯(時間約25 s～30 s)，1次/日，10次作為1個療程，療程之間休息2天，施行9個療程后結(jié)束治療。實(shí)驗(yàn)中意外燙傷處理可涂濕潤燒傷膏少許予穴位處；在治療過程中，可能由于轉(zhuǎn)基因模型小鼠較正常鼠身體素質(zhì)偏弱，治療組小鼠死亡1只，模型組死亡2只，予以剔除。

1.5　觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1組織取材3組實(shí)驗(yàn)小鼠治療結(jié)束→腹腔麻醉暴露胸腔→予生理鹽水和多聚甲醛灌注心臟→開顱取腦多聚甲醛固定→常規(guī)石蠟包埋→視交叉前后冠狀切片→讀片。

1.5.2尼氏體染色取相鄰部位的腦片→石蠟切片脫臘→蒸餾水洗→放甲苯胺藍(lán)水溶液→烤箱孵育→蒸餾水洗→乙醇快速脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片→光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.5.3APP免疫組化取切片→置烤箱烘烤→常規(guī)脫蠟至水→微波修復(fù)抗原→入枸椽酸鹽緩沖液中置在微波爐中加熱→洗滌阻斷過氧化物酶→PBS洗→滴加稀釋的一抗→孵育(APP為1∶150)PBS洗→滴加二抗→孵育PBS洗→DAB顯色→復(fù)染透明后封片→顯微鏡觀察→以切片海馬區(qū)和額葉皮層各取6個視野(×400)→采用計(jì)算機(jī)分析(圖像分析軟件Image Pro-plus5.0)測量陽性面積(area)、總光密度值(Integrated optical density)→數(shù)據(jù)匯總。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2　結(jié)果

2.1　APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)額葉皮層及海馬區(qū)尼氏體染色觀察早期神經(jīng)元損傷的情況

尼氏體染色后，光鏡下可見正常組小鼠額葉皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元胞核染成藍(lán)色，胞漿中尼氏小體呈深藍(lán)色，均勻分布于細(xì)胞核的周圍。觀察模型組和治療組實(shí)驗(yàn)小鼠切片的海馬區(qū)及皮層區(qū)尼氏體數(shù)量未見明顯減少，神經(jīng)元形態(tài)及排列與正常組比較無明顯差異。提示，5月齡的Tg6799模型小鼠腦內(nèi)尚未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元丟失。見封三彩圖2。

2.2　APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)額葉皮層及海馬區(qū)淀粉樣前體蛋白(APP)沉積的變化

各組小鼠大腦額葉皮層及海馬區(qū)可見棕黃色陽性表達(dá)，主要位于細(xì)胞胞漿和胞膜而細(xì)胞核呈陰性。

從鏡下觀察顯示,見封三彩圖3。在模型組大腦額葉皮層、海馬區(qū)陽性細(xì)胞明顯多，胞漿著色明顯加深，與模型組比較，治療組和正常組陽性細(xì)胞數(shù)量少，胞漿著色變淺。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,見表1，與正常組和治療組比較，模型組大腦皮層陽性面積明顯增加，差異顯著(P<0.01)，總光密度值增高(P<0.05或P<0.01)；模型組海馬區(qū)陽性面積和總光密度均增高(P<0.05);而治療組和正常組陽性表達(dá)相仿，但著色淺明顯低于模型組，無顯著性差異(P>0.05)。

表1　各組小鼠海馬額葉皮層淀粉樣前體蛋白APP表達(dá)的比較

注：與模型組比較,*P<0.01，▲P<0.05

3　討論

阿爾茨海默病(AD)是一種漸進(jìn)的、不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和最常見一種癡呆。目前，世界上有超過3650萬人受到癡呆的影響，其中大多數(shù)都是與AD有關(guān)。據(jù)估計(jì)，在老年人群中，每年有500～700萬新發(fā)病例。目前臨床沒有任何治療方法來預(yù)防或減緩疾病的進(jìn)展[8-9]。AD的發(fā)病及病理過程是一個漫長的過程。大量的研究和臨床實(shí)踐表明AD的病理改變過程要早于臨床診斷很多年，在AD發(fā)病后，尤其是中晚期，各種治療方法的效果并不理想?！暗矸蹣拥鞍准壜?lián)假說”是由Hardy等[10]學(xué)者于1992年提出的，是目前較為公認(rèn)的AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說。該學(xué)說所描述的AD病理過程的進(jìn)展為：APP等基因突變的發(fā)生使Aβ的產(chǎn)物增加并發(fā)生Aβ的凝集、沉積，之后可繼發(fā)性的發(fā)生突觸可塑性的破壞、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生、神經(jīng)元損傷、神經(jīng)元內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)改變、tau蛋白過度磷酸化、大量的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，最終可導(dǎo)致癡呆。淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是與AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的一類I型跨膜蛋白，具有膜受體樣結(jié)構(gòu)。在生物體內(nèi)的水解途徑有兩種，其中APP是經(jīng)β分泌酶和γ分泌酶的順次切割后形成的肽,而淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)被認(rèn)為是AD主要誘因[11-14]。APP廣泛表達(dá)，尤其在神經(jīng)元中有很高的濃度[15]。Shaked 等[16]提出，Aβ與APP相互作用，Aβ位于APP的疏水部分，具有很強(qiáng)的聚集性，易形成極難溶解的沉淀。經(jīng)過一系列的級聯(lián)反應(yīng)，最終會引起細(xì)胞凋亡；而作用的位點(diǎn)正是APP上的Aβ區(qū)域。家族性阿爾茨海默病(FAD) 發(fā)生可見APP 基因突變[17]，而APP基因突變導(dǎo)致Aβ的生成和聚合的增加最終轉(zhuǎn)人類FAD 基因的小鼠可表現(xiàn)為類似人類阿爾茨海默病的癥狀[18]。尼氏小體是神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的一種物質(zhì)，與神經(jīng)細(xì)胞的功能密切相關(guān)，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞病變時，尼氏小體的數(shù)量減少、位置改變，甚至溶解、消失，是觀察神經(jīng)細(xì)胞損傷的一項(xiàng)指標(biāo)[19]。

阿爾茨海默病是西醫(yī)學(xué)病名，祖國醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)理論中雖未出現(xiàn)此病的專門記載，但是根據(jù)其相關(guān)癥狀、病因、病機(jī)，可將其歸為“健忘”“呆病”“善忘”“郁證”“顛證”等范疇。“癡呆”病名始見于漢代《華佗神醫(yī)秘傳》。明朝李中梓在《醫(yī)宗必讀》記載:“心不下交于腎，則火亂其神明，腎不上交于心，精氣伏而不用，火居上則因而生 ，水居下則因而生燥，擾擾紜紜，昏而不寧。故補(bǔ)腎使之時上，養(yǎng)心使之善下，則神氣清明，志意常治而何健忘之有”,說明心腎陰血虧虛，致水火不濟(jì)是健忘癡呆的常見原因。林永淼等[20]認(rèn)為癡呆發(fā)生主要責(zé)于心腎，心氣不足腎陽虛衰神明失用、腦失所養(yǎng)為疾病之本。中醫(yī)自古有論，《素問·四氣調(diào)神大論》提到：“是故圣人不治已病治未病，不治已亂治未亂，此之謂也”。自古中醫(yī)“治未病”的預(yù)防思想是中醫(yī)養(yǎng)生保健理論的精髓之一。艾灸有防病保健的作用，《扁鵲心書》說：“保命之法，灼艾第一”，古代醫(yī)家都提倡用艾灸延緩衰老。有研究報道，艾絨燃燒過程中熱感可穿透機(jī)體組織以誘導(dǎo)肌肉生成一類熱激蛋白質(zhì)最終激發(fā)免疫系統(tǒng)，從而起到治病強(qiáng)身健體的作用[21]。另有艾灸通過改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝和延緩衰老等功效來達(dá)到防病保健的作用[22]。而麥粒灸屬于艾灸療法中的一種，將麥粒大小艾炷，置于腧穴上點(diǎn)燃施灸，當(dāng)艾炷燃剩2/5至1/4患者皮膚會感到微有灼痛時易炷再灸以規(guī)定數(shù)壯灸完為結(jié)束治療，多以局部皮膚出現(xiàn)紅暈而不起泡為度。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠是大多研究學(xué)者公認(rèn)的比較成功的轉(zhuǎn)基因AD模型，攜帶突變APP和PSl基因的雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠能夠模擬AD患者腦內(nèi)主要的神經(jīng)病理過程及模擬AD行為學(xué)表現(xiàn)和病理學(xué)改變。其腦內(nèi)淀粉樣蛋白沉積部位與人類AD患者相似，主要存在于大腦皮層及海馬。本課題采用B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型的一種，與其它轉(zhuǎn)基因AD小鼠比較，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠有APP高負(fù)荷超表達(dá)的特征，在1.5月齡小鼠的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可以看到Aβ1-42聚集，2月齡小鼠出現(xiàn)淀粉樣蛋白沉積[23]。

綜上所述，研究表明Tg6799雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠1.5月齡時已表現(xiàn)APP及Aβ1-42的沉積，2月齡時老年斑隨之出現(xiàn)，且隨著年齡的增長其記憶能力越來越差，為了探究麥粒灸能否改善AD癥狀，筆者開始給1.5月齡AD小鼠介入麥粒灸療法，經(jīng)過9個療程的治療，即AD小鼠5月齡時，通過病理學(xué)和基因生物學(xué)水平實(shí)驗(yàn)之后，通過對小鼠腦組織切片進(jìn)行尼氏體染色后發(fā)現(xiàn)，正常組、模型組及治療組小鼠海馬區(qū)及額葉皮層神經(jīng)元形態(tài)及排列均較整齊，胞漿中尼氏小體呈深藍(lán)色，均勻分布于細(xì)胞核的周圍，尼氏體數(shù)量也均未見明顯減少，表明5月齡的Tg6799小鼠腦內(nèi)尚未發(fā)生明顯的神經(jīng)元缺失。這與近年來國內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)動物研究結(jié)果一致，且和“淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”提出的AD病理進(jìn)程中神經(jīng)元損傷是由于Aβ低聚反應(yīng)過程中具有神經(jīng)毒性的產(chǎn)物導(dǎo)致有關(guān)記憶形成的信號傳導(dǎo)發(fā)生障礙的理論[24]契合。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與模型組比較，AD小鼠額葉皮層和海馬區(qū)APP的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。本研究不僅肯定了麥粒灸的療效，也豐富了中醫(yī)“治未病”的理念，隨著老齡化人口的增長，有必要進(jìn)行更深入的研究，不僅探討艾灸治療AD的機(jī)制，也要將艾灸“治未病”的理念宣傳教育，應(yīng)用于更多AD患者。

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