譚　平,劉斯宇,周太平,孫冬梅,彭長江，杜　波,任　丹,楊錫良,王周玉*(.西華大學(xué)理學(xué)院,四川　成都　60039；.成都新朝陽作物科學(xué)有限公司，四川　成都　60039)

眾所周知，植物源農(nóng)藥由于其低毒、易分解、少殘留、環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，是生產(chǎn)無公害農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)先選用的農(nóng)藥品種[1]；但是，該類農(nóng)藥具有防治效果緩慢、控制有害生物的范圍較窄、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)。所以，利用植物源農(nóng)藥中活性較高的天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化，以保持其低毒、改善其活性是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域研究低毒新型農(nóng)藥的重要方向。

沒食子酸亦稱“五倍子酸”“棓酸”，廣泛存在于掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物中，是一種天然的多酚類化合物，在食品、生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[2-22]。據(jù)國內(nèi)、外文獻(xiàn)報(bào)道，利用沒食子酸為骨架結(jié)構(gòu)修飾的研究很多；但主要集中在人用抗菌、抗腫瘤、消炎等藥物的研發(fā)，將其結(jié)構(gòu)修飾后用于農(nóng)藥的研究報(bào)道很少。國內(nèi)除了李悅等[8]報(bào)道了3,4,5- 三羥基苯甲酸甲酯的抑菌特性及其對番茄青枯病的田間防治作用外，宋寶安等[18-20]將沒食子酸的酚羥基和羧基同時(shí)進(jìn)行了修飾，將改性后的沒食子酸衍生物用于各種農(nóng)作物的抑菌活性及抗病毒研究，取得了較好的研究結(jié)果。但到目前為止，還沒有一個(gè)由沒食子酸改性化合物取得農(nóng)藥登記證，所以，針對沒食子酸改性衍生物在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用還存在很大的研究空間。

本文采用廉價(jià)的沒食子酸為原料，保留其酚羥基基團(tuán)，衍生合成了4個(gè)新型化合物(圖1：1，2a，2b，3)，同時(shí)考察了4種化合物對蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果輪紋病菌、立枯絲核菌病菌以及馬鈴薯晚疫病菌的殺菌效果。

Reagents and conditions:(a)(CH3)2SO4,NaOH,H2O,100 ℃,4 h,82.1%;(b)CCl4,PPh3,Et3N,MeCN,12 h,80%;(c)SOCl2,DCM,rt,12 h,pyridine,MeCN,0 ℃,1 h,70%;(d)BBr3,DCM,rt,3 h,89.6%;(e)Me2S,AlCl3,DCM,8 h,rt,76.4%;(f)160 ℃～170 ℃,3 h,11%;(g)CF3COOH,DCM,40 ℃,12 h,94%;(h)NaBH4,MeOH,0 ℃,2 h,93%;(i)BBr3,DCM,rt,3 h,83%.

圖1衍生物合成路線

1　實(shí)驗(yàn)合成部分

1.1　原料和儀器

1.1.1原料

沒食子酸(成都瑞歐克科技有限公司) ;甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、氫氧化鈉、濃鹽酸、三苯基膦、乙腈、無水硫酸鎂、間氯苯胺、硼氫化鈉、二氯亞砜、吡啶、三氟乙酸、四氯化碳、三乙胺、三氯化鋁(分析純，成都科龍化工試劑廠) ;硫酸二甲酯(成都化夏化學(xué)試劑有限公司/北京公司);三溴化硼、二甲硫醚、二氨基硫脲、鹽酸氨基脲(安耐吉化學(xué))。

1.1.2儀器

1H NMR和1C NMR Bruker-400 MHz型核磁共振波譜儀；BSM-120.4電子天平；ZF-6型三用紫外分析儀。

1. 2　方法步驟

1.2.1N -(3 -氯苯基)-3,4,5-三羥基-苯甲酰胺的合成(1)

將沒食子酸(8.5 g，50 mmol)，100 mL水加入帶有冷凝回流管的250 mL四口瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌，加入氫氧化鈉(4.8 g，120 mmol)及硫酸二甲酯(15.0 g，120 mmol)。10 min后再次加入硫酸二甲酯(15.0 g，120 mmol)，投料過程溫度低于35 ℃，硫酸二甲酯加完后攪拌0.5 h。再加入氫氧化鈉(4.8 g，120 mmol)，回流3 h。反應(yīng)液冷卻至室溫后，用濃鹽酸酸化至pH=2，抽濾得白色固體，用水重結(jié)晶，干燥，得8.7 g無色針狀晶體M-1。

準(zhǔn)確稱取中間體M-1(0.64 g，3 mmol)、三苯基膦(1.89 g，7.2 mmol)加入一干燥的100 mL梨形瓶，以15 mL乙腈作反應(yīng)溶劑使其溶解，冷卻至0 ℃下，緩慢滴加四氯化碳(4.62 g，30 mmol)，滴加完畢在該溫度下攪拌反應(yīng)2 h。將間氯苯胺(0.255 g，2 mmol)和三乙胺(0.61 g，6 mmol)用2 mL乙腈溶解，緩慢滴加到反應(yīng)液，滴加完畢繼續(xù)在該溫度下攪拌反應(yīng)10 min，然后緩慢升溫至室溫直至反應(yīng)完全。TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全后，減壓濃縮后柱層析得0.77 g白色固體M-2。

以20 mL二氯甲烷溶解M-2(0.64 g，2 mmol)于一干燥的50 mL梨形瓶中，0 ℃下，緩慢滴加三溴化硼溶液(2.51 g，10 mmol)，滴加完畢，繼續(xù)在該溫度下攪拌反應(yīng)10 min，然后緩慢升溫至30 ℃反應(yīng)3 h，TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全后，0 ℃下用預(yù)冷的甲醇(5 mL)淬滅反應(yīng)，減壓濃縮后柱層析得0.50 g白色固體1收率58.8%。

1.2.22-(3,4,5-三甲氧基苯基)-氨基脲的合成(2a和2b)

準(zhǔn)確稱取M-1(1.06 g，5 mmol)，取一干燥的100 mL梨形瓶，以50 mL二氯甲烷作反應(yīng)溶劑使其溶解，0 ℃下緩慢滴加二氯亞砜(0.72 g，6 mmol)，加畢，室溫下攪拌反應(yīng)12 h。減壓除去二氯甲烷，加入20 mL乙腈使其溶解，0 ℃下緩慢滴加至鹽酸氨基脲(0.67 g，6 mmol)和吡啶(1.96 g，25 mmol)的乙腈溶液中(40 mL)，滴加完畢升溫至室溫反應(yīng)1 h，TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全后，減壓濃縮后柱層析得0.942 g白色固體M-3。

取一干燥的50 mL梨形瓶，0 ℃下將二甲硫醚(5.05 g，82 mmol)滴加到三氯化鋁(1.96 g，6 mmol)的懸浮液中，準(zhǔn)確稱取M-3(0.81 g，3.0 mmol)，用二氯甲烷將其溶解，將M-3的二氯甲烷溶液滴加到二甲硫醚中，0 ℃下攪拌反應(yīng)10 min，緩慢升溫至室溫直至反應(yīng)完全。TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全后，用冰鹽酸淬滅反應(yīng)，減壓除去溶劑，乙酸乙酯萃取(75 mL× 3)，收集有機(jī)層，無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮后柱層析得最終產(chǎn)品2。其中2a為黃色固體，收率44%，2b為灰白色固體，收率47%。

1.2.34-((3-氟芐基)氨基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H- 1,2,4-三唑-5(4H)-硫酮(3)

取一干凈25 mL梨形瓶，準(zhǔn)確稱取M-1(2.12 g，10 mmol)，二氨基硫脲(1.06 g，10 mmol)加入反應(yīng)瓶中，升溫至160～170 ℃，待反應(yīng)混合物熔融，在該溫度下繼續(xù)反應(yīng)3 h，TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全后，反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入少量熱水洗滌，有白色絮狀物析出，過濾收集該絮狀物，干燥后無水乙醇重結(jié)晶得白色固體M-4(0.31 g，11%收率)。

（1）單列“稅金及附加”總賬科目，并在“業(yè)務(wù)活動表”中單列“稅金及附加”項(xiàng)目，以核算、列示民非組織計(jì)提的各項(xiàng)流轉(zhuǎn)稅、附加稅及其他稅費(fèi)。

取一干凈50 mL梨形瓶，準(zhǔn)確稱取M-4(0.236 g，0.84 mmol)，間氟苯甲醛(0.114 g，0.92 mmol)，三氟乙酸(0.096 g，0.84 mmol)加入其中，20 mL二氯甲烷溶解，于40 ℃溫度下回流反應(yīng)過夜，TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全，減壓濃縮后柱層析(二氯甲烷 ∶甲醇=30 ∶1)得白色固體M-5(0.31 g，94%收率)。

準(zhǔn)確稱取M-5(0.280 g，0.72 mmol)于一干凈50 mL梨形瓶，以10 mL無水甲醇作為反應(yīng)溶劑使之溶解，0 ℃下分批加入硼氫化鈉粉末(0.40 g，10.8 mmol)，加畢，繼續(xù)在該溫度下攪拌反應(yīng)2 h，TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全，0 ℃下滴加2 mL丙酮淬滅反應(yīng)，減壓濃縮后柱層析得中間體白色固體M-6(0.26 g，93%收率)。

以10 mL二氯甲烷溶解M-6(0.25 g，0.64 mmol)于一干燥的50 mL梨形瓶，0 ℃下，緩慢滴加三溴化硼溶液(0.88 g，8.32 mmol)，滴加完畢，繼續(xù)在該溫度下攪拌反應(yīng)10 min，然后緩慢升溫至30 ℃反應(yīng)3 h，TLC檢測反應(yīng)情況，待反應(yīng)完全后，0 ℃下用預(yù)冷的甲醇(5 mL)淬滅反應(yīng)，減壓濃縮后柱層析得白色固體最終化合物4，收率6.6%。

1.3　產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

所有最終產(chǎn)物通過1H NMR、13C NMR和HRMS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，通過數(shù)據(jù)分析結(jié)構(gòu)正確。

N -(3 -氯苯基)-3,4,5-三羥基-苯甲酰胺(1)的表征數(shù)據(jù)：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.07 (s, 1H), 9.10 (br s, 3H), 7.96 (s, 1H), 7.69 (d, J=7.84 Hz, 1H), 7.35 (t, J=8.04 Hz, 1H), 7.11 (dd, J=7.92, 1.68 Hz, 1H), 6.97 (s, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 166.26, 145.99, 141.58, 137.54, 133.31, 130.63, 124.99, 123.22, 119.90, 118.84, 107.74. HRMS (AP-ESI) Calcd. for C13H10ClNO4: 280.0377 (M+H)+. Found: 280.0374。

2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-氨基脲2a的表征數(shù)據(jù)：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.70 (s, 1H), 9.06 (br s, 3H), 7.70 (s, 1H), 6.87 (s, 2H), 5.89 (br s, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 166.93, 159.75, 145.85, 137.12, 123.35, 107.53. HRMS (AP-ESI) Calcd. For C8H9N3O5: 250.0440 (M+Na)+. Found: 250.0432。

4-((3-氟芐基)氨基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H- 1,2,4-三唑-5(4H)-硫酮(3)：1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 13.77 (br s, 1H), 9.20 (s, 2H), 8.67 (s, 1H), 7.34 - 7.28 (m, 1H), 7.13 - 7.06 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 6.51 (t, J=5.80 Hz, 1H), 4.24 (d, J=5.68 Hz, 2H).13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 166.36, 163.66, 161.24, 149.85, 146.25, 139.06, 136.24, 130.58, 125.60, 116.37, 116.16, 115.68, 115.02, 114.81, 107.40, 52.49. HRMS (AP-ESI) Calcd. for C15H13FN4O3S: 349.0771 (M+H)+. Found: 349.0767。

2　抑菌活性的測定

2.1　原料與儀器

原料：蘋果斑點(diǎn)落葉、蘋果輪紋、立枯絲核菌、草莓炭疽、馬鈴薯晚疫真菌(成都新朝陽作物有限公司)；葡萄糖、瓊脂、二甲亞砜、吐溫80(成都市科龍化工試劑廠)。

儀器：SGSP-02恒溫隔水式培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；BHC-1300 A2SPX-150-Ⅱ生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；JA2003N電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；YAIB濕熱滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

2.2　實(shí)驗(yàn)步驟

采用生長速率法測定沒食子酸衍生物對蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果輪紋病菌、立枯絲核菌病菌、草莓炭疽病菌、馬鈴薯晚疫病菌的抑菌活性。

1)制作PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯先洗凈去皮,再稱取200 g切成薄片，加水煮爛(煮沸20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用四層紗布過濾，加熱，再加18 g瓊脂(邊加邊攪拌，直到完全溶解)，加入20 g葡萄糖，攪拌均勻，補(bǔ)足水分至1 000 mL，分裝錐形瓶，封口，高壓滅菌鍋(121 ℃)滅菌30 min后備用。

2)本實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以加入等量的溶劑為空白對照。實(shí)驗(yàn)藥劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×10-4。分別取藥劑1 mL于培養(yǎng)皿中，加入9 mL PDA培養(yǎng)基，輕輕搖勻，做好標(biāo)記，水平放置到冷卻。用打孔器在擴(kuò)繁成功的培養(yǎng)基內(nèi)，按同心圓周打孔。再接種到培養(yǎng)基的中心，倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)?？瞻讓φ站χ睆綖榕囵B(yǎng)皿直徑的2/3左右，測各個(gè)處理的菌圈直徑。在空白菌絲長至撲滿2/3平板時(shí)，采用十字交叉法測定菌落直徑，計(jì)算平均直徑大小，計(jì)算藥劑抑菌率。

抑菌率計(jì)算公式：I=[(D0-Dt)/(D0-4)]×100%。

I為菌絲生長抑制率；D0為空白菌落直徑；Dt為藥劑處理菌落直徑(農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑 NYT1156.2-2006)。

2.3　抑菌活性結(jié)果

從表1可以看出4個(gè)化合物對蘋果斑點(diǎn)落葉病菌和蘋果輪紋病菌都有一定的抑菌活性，特別針對蘋果輪紋病菌，改性后的衍生物效果都優(yōu)于沒食子酸，抑制率分別為49.0%、42.4%、48.1%以及51.3%。衍生物2b和3對立枯絲核菌的抑制率優(yōu)于沒食子酸，分別為35.4%和33.7%。4個(gè)衍生物對于馬鈴薯晚疫病菌沒有效果。

表1　衍生物1、2a、2b和3的抑菌活性

3　結(jié)論

本文以沒食子酸為原料衍生合成了4個(gè)新化合物，經(jīng)過氫譜、碳譜和質(zhì)譜進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)對其抑菌活性進(jìn)行了初步篩選。4個(gè)化合物都對蘋果斑點(diǎn)落葉和蘋果輪紋有一定的抑菌活性，衍生物2b和3對立枯絲核菌和蘋果輪紋病菌的抑制率高于沒食子酸。

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