周海柱，高云航，徐　博，陶大鵬，滕戰(zhàn)偉，婁玉杰

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118)

研究表明，鵝可以利用飼料中的粗纖維，添加適宜的粗纖維不僅可提高鵝生產(chǎn)性能，而且可以促進(jìn)鵝消化道的發(fā)育以及維持腸道的健康[1-2]。鵝利用粗纖維的特性與消化道及腸道菌群結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[3]。盲腸是消化利用纖維的重要場所[4]，鵝具有發(fā)達(dá)的盲腸，其內(nèi)容物pH和排空時(shí)間為微生物的定植創(chuàng)造了較好的條件[5]，與其他腸段相比，盲腸菌種種類最為豐富[6]。盲腸微生物在鵝營養(yǎng)消化吸收、黏膜代謝、免疫應(yīng)答等生長發(fā)育過程中具有重要作用[4,7]。赫忠睿[8]、戰(zhàn)利[9]、劉蓓一[3]研究了不同日糧纖維水平對鵝腸道內(nèi)菌群多樣性和豐度的影響，結(jié)果表明，提高日糧纖維水平可影響盲腸微生物多樣性，而且可改變部分細(xì)菌的豐度。但目前鵝腸道微生物的研究方法多為體外培養(yǎng)、PCR-DGGE等分子生物學(xué)技術(shù)，而自然界中超過99%的微生物是不能被培養(yǎng)的[10]，目前對鵝腸道細(xì)菌的研究普遍只能檢測到較少部分細(xì)菌[11]。隨著高通量測序策略技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，無需對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)即可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的鑒定與分類，而且測序深度不斷提高、讀長不斷增長，大大提高了測序結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。Illumina公司開發(fā)的MiSeq測序平臺有效解決了通量低、操作復(fù)雜等問題，目前已廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性研究[13-15]。

本研究利用MiSeq PE300測序平臺，采用雙末端測序方法，通過OTUs聚類以及物種注釋和豐度分析，揭示鵝盲腸黏膜微生態(tài)的特點(diǎn)，全面深入比較飼喂不同纖維水平日糧鵝腸道黏膜菌群結(jié)構(gòu)的差異，為揭示鵝消化利用日糧纖維的機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取體重相近的35日齡健康卡洛斯公鵝90只，隨機(jī)分為2組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15只，試驗(yàn)期為42 d。參考NRC(1994)，以苜蓿為纖維源，配制成粗纖維5%和8%的2個水平，5%日糧纖維水平記為L組、8%日糧纖維水平記為H組，日糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

1.2　飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)鵝基地進(jìn)行，采用半開放式鵝舍，地面圈養(yǎng)，自由采食與飲水。

表1日糧組成及營養(yǎng)水平

Table1Compositionsandnutrientlevelsofdiets

%

1). 每千克預(yù)混料含：維生素A 800 000 IU，維生素D 160 000 IU，維生素E 500 IU，鋅8 000 mg，錳6 000 mg，鐵6 000 mg，銅800 mg，碘35 mg，硒30 mg，維生素K 50 mg，硫胺素80 mg，核黃素250 mg，泛酸220 mg，煙酸2 000 mg，吡哆醇300 mg，生物素10 mg，葉酸25 mg。2). 代謝能與酸性洗滌纖維為計(jì)算值，其他營養(yǎng)水平為實(shí)測值

1). The premix provided per kilogram of diet:800 000 IU VA, 160 000 IU VD, 500 IU VE, 8 000 mg of zinc as zinc oxide, 6 000 mg of manganese as manganous oxide, 6 000 mg of iron as iron sulfate, 800 mg of copper as copper sulfate, 35 mg of iodine as calcium iodate, 30 mg of selenium as sodium selenite, 50 mg VK, 80 mg thiamin mononitrate, 250 mg riboflavin, 220 mg calcium pantothenate, 2 000 mg nicotinic acid, 300 mg pyridoxine hydrochloride, 10 mg biotin, 25 mg folic acid.2). ME and ADF were calculated values, while the other nutrieat levels were measured values

1.3　樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，在3個重復(fù)中分別隨機(jī)選取1只卡洛斯鵝進(jìn)行屠宰，迅速取出盲腸并進(jìn)行結(jié)扎，經(jīng)75%酒精擦拭消毒后轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺內(nèi)，將盲腸剪開，用無菌生理鹽水沖洗腸道內(nèi)壁，沖洗干凈后，用滅菌手術(shù)刀片輕輕刮取腸道黏膜，收集于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　鵝盲腸黏膜細(xì)菌DNA提取與文庫測序

鵝盲腸黏膜細(xì)菌總DNA提取按照QIAamp DNA Mini kit步驟進(jìn)行。細(xì)菌DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化回收后采用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina進(jìn)行文庫的構(gòu)建，使用MiSeq PE300上機(jī)測序。

1.5　測序結(jié)果分析

測序平臺得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)拆分、PE Reads拼接[16]、Tags過濾[17]和去嵌合體序列后得到有效Tags[18]。采用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)[19]將樣本有效Tags聚類成不同的操作分類單元(OTUs)，并進(jìn)行物種注釋和樣品復(fù)雜度分析。

1.6　數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0軟件以及Metastats方法對各處理組間差異性進(jìn)行分析。

2　結(jié)　果

2.1　鵝盲腸黏膜細(xì)菌測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評價(jià)及OTU分析

本研究對盲腸黏膜細(xì)菌樣本進(jìn)行了測序，經(jīng)過數(shù)據(jù)的拆分、拼接、過濾和去嵌合體等一系列處理后，共得到有效序列(Effective tags)數(shù)為297 023條，平均每個樣本Effective tags數(shù)為49 504條，Effective tags的平均長度為253 nt，錯誤率小于1%的堿基百分比為98.59%，錯誤率小于0.1%的堿基百分比為97.25%，測序數(shù)據(jù)正確可靠。

以97%相似度為聚類閾值，8%纖維水平組(H組)、5%纖維水平組(L組)盲腸樣本OTUs分別為1 008和903個，兩組共有OTUs為708個，如圖1所示。

圖1　不同處理組鵝盲腸細(xì)菌OTU韋恩圖Fig.1　Venn diagrams for OTUs of different groups in cecum of goose

2.2　鵝盲腸樣品細(xì)菌Alpha 多樣性分析

在97%相似度水平下，對兩組處理的Chao1和Shannon進(jìn)行顯著性分析(表2)，均無顯著性差異(P>0.05)，表明兩個處理組菌群多樣性無顯著性差異。

表2鵝盲腸樣品細(xì)菌Alpha多樣性

Table2BacteriaAlphaindexesincecumsamplesofgoose

樣品名稱SamplenameChao1指數(shù)(97%)Chao1index(97%)香濃指數(shù)(97%)Shannonindex(97%)H887±725.95±0.80L909±1996.42±0.82

2.3　鵝盲腸菌群不同日糧纖維組間的差異性分析

2.3.1鵝盲腸菌群不同日糧纖維組在門水平上的差異性分析研究將相對豐度含量大于0.1%的菌門視為優(yōu)勢菌門，H和L優(yōu)勢菌門的數(shù)量分別為9和10。門水平上相對豐度排名前10的門豐度分布見圖2所示。相對豐度排名前10的門依次分別是Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Deferribacteres(脫鐵桿菌門)、Synergistetes(互養(yǎng)菌門)、Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌門)、Tenericutes(軟壁菌門)、Euryarchaeota(廣古菌門)、Actinobacteria(放線菌門)，其中，H組相對豐度含量較高的前4菌門分別為Proteobacteria(37.15%)、Firmicutes(30.60%)、Bacteroidetes(25.58%)、Verrucomicrobia(4.86%)，占總豐度的98%以上；L組中豐度含量較高的前4的菌門為Firmicutes(35.38%)、Bacteroidetes(30.97%)、Proteobacteria(28.57%)、Synergistetes(1.72%)，占總豐度的96%以上。

對H組和L組的優(yōu)勢菌門相對豐度進(jìn)行差異顯著性分析，其中有顯著性差異的菌門如表3所示。H組Verrucomicrobia、Deferribacteres相對豐度顯著高于L(P<0.05)，Synergistetes、Euryarchaeota則顯著低于L組(P<0.05)。

圖2　各樣本在門水平上的物種相對豐度Fig.2　Relative abundance of species of samples at phylum level

表3在門水平上鵝盲腸菌群不同纖維組差異性分析

Table3Differenceanalysisofgoosececummicrofloraatphylumlevelbetweenthetwogroups

%

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。下表同

Different letters in the same row mean significant difference between the groups(P<0.05), the same letter in the same row means not significant difference between the groups(P>0.05). The same as the following tables

2.3.2鵝盲腸菌群不同纖維組在屬水平上的差異性

分析在屬水平上，H組檢測出的細(xì)菌屬于17門類的199個屬，相對豐度含量大于0.1%的屬有22個，占細(xì)菌總豐度的59%；L組檢測出的細(xì)菌屬于19門類的226個屬，相對豐度含量大于0.1%的屬有24個，占細(xì)菌總豐度的55%。將相對豐度含量大于0.1%的菌屬視為優(yōu)勢菌屬，相對豐度柱形圖見圖3。H組部分優(yōu)勢菌屬的相對豐度：Desulfovibrio(22.02%)、Bacteroides(11.24%)、Prevotella(7.48%)、Oscillospira(4.87%)、Megamonas(3.18%)、Ruminococcus(2.11%)、Lactobacillus(1.78%)、Faecalibacterium(1.62%)、Akkermansia(1.29%)、Helicobacter(1.24%)； L組部分優(yōu)勢菌屬的相對豐度：Bacteroides(17.83%)、Desulfovibrio(17.80%)、Oscillospira(5.41%)、Prevotella(2.56%)、Megamonas(2.41%)、Lactobacillus(2.56%)、Ruminococcus(1.97%)、Faecalibacterium(1.07%)。

圖3　各樣本在屬水平上的物種相對豐度Fig.3　Relative abundance of spieces of samples at genus level

為了比較各處理組在屬水平上菌群構(gòu)成的差異，分別對各處理組優(yōu)勢菌屬進(jìn)行差異顯著性分析，其中有顯著性差異的菌屬如表4所示。H組Desulfovibrio、Prevotella、Helicobacter、Mucispirillum和Akkermansia菌屬相對豐度顯著高于L組(P<0.05)；L組Bacteroides、Methanobrevibacter菌屬相對豐度顯著高于H組(P<0.05)。

表4屬水平上盲腸菌群不同纖維組差異性分析

Table 4　Difference analysis of goose cecum microflora at genus level between the two groups %

3　討　論

鵝具有發(fā)達(dá)的盲腸[20,5]，與其他腸段相比，盲腸菌種種類最為豐富[6]。由于腸道內(nèi)容物流動性等原因，內(nèi)容物細(xì)菌多為過路菌，腸道黏膜細(xì)菌才是定植細(xì)菌的主體[21]。以細(xì)菌16S rRNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)由于其快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢，在細(xì)菌菌株的鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用[22]。本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對盲腸黏膜細(xì)菌進(jìn)行了分析，8%纖維水平組檢測出的細(xì)菌屬于17門類的199個屬，5%纖維水平組檢測出的細(xì)菌屬于19門類的226個屬，與以往鵝盲腸微生態(tài)研究結(jié)果相比，細(xì)菌的多樣性明顯提高。張名愛等[23]研究指出，鵝盲腸內(nèi)優(yōu)勢菌群為雙歧桿菌、梭菌和乳酸桿菌，而本研究中，Desulfovibrio(脫硫弧菌)、Bacteroides(擬桿菌)、Prevotella(普氏菌)、Oscillospira(顫螺旋菌)、Megamonas(巨單胞菌)、Ruminococcus(瘤胃球菌屬)、Lactobacillus(乳酸菌)、Faecalibacterium、Akkermansia、Helicobacter(螺桿菌)均為相對豐度較高的優(yōu)勢菌屬，與張名愛等[23]等研究結(jié)果不一致，一方面可能是由于鵝腸道黏膜和食糜中微生態(tài)存在一定的差異，另一方面可能是由于高通量技術(shù)具有無需分離培養(yǎng)菌群、客觀還原菌群結(jié)構(gòu)和測序深度高等優(yōu)勢。

動物對飼料中營養(yǎng)成分的消化吸收在一定程度上取決于腸道內(nèi)微生物菌群的分布與數(shù)量，日糧組成對腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)具有一定的影響[5,24]。A.Awati等[25]研究指出，動物腸道優(yōu)勢菌群受日糧組成的影響，且日糧纖維是影響優(yōu)勢菌群的重要因素。赫忠睿[8]、戰(zhàn)利[9]研究指出，提高日糧纖維水平影響了鵝腸道內(nèi)菌群的多樣性和豐度。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提高日糧纖維水平對細(xì)菌多樣性無顯著影響，但可顯著影響部分細(xì)菌的豐度。提高日糧纖維水平可導(dǎo)致纖維分解菌以及在纖維降解中具有供能等作用的菌屬豐度的增加。隨著日糧纖維水平的提高，Verrucomicrobia、Deferribacteres菌門和Desulfovibrio、Prevotella、Helicobacter、Mucispirillum、Akkermansia菌屬相對豐度顯著增加；Synergistetes、Euryarchaeota菌門和Bacteroides、Methanobrevibacter菌屬相對豐度顯著降低。Desulfovibrio被證實(shí)在纖維降解中具有重要作用[26]，Prevotella菌屬含有可降解纖維的細(xì)菌[27]。Bacteroides是中溫厭氧纖維素降解細(xì)菌，隨日糧纖維水平升高而降低，機(jī)理需要進(jìn)一步研究。本研究中，8%纖維水平組Akkermansia相對豐度顯著高于5%纖維水平組，Akkermansia菌具有改善糖代謝和降低盲腸脂肪組織炎癥的作用[10]，可能與8%纖維日糧造成的盲腸炎癥反應(yīng)有關(guān)。

由于纖維水平不同導(dǎo)致鵝腸道菌群多樣性和豐度差異的菌群并不一定直接參與腸道內(nèi)纖維的分解。戰(zhàn)利[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂8.08%纖維水平日糧吉林白鵝腸道內(nèi)容物埃希菌、糞腸球菌明顯高于3.71%纖維水平組，但是這兩組菌株均不能直接分解纖維素。單個菌株的纖維分解能力有限，甚至在體外試驗(yàn)中喪失纖維分解能力。另外，鵝腸道中除細(xì)菌外，還含有大量的真菌、病毒等微生物，其中部分具有纖維分解能力。綜上，鵝腸道內(nèi)纖維素的分解是一個復(fù)雜的過程，是多種微生物共同作用的結(jié)果，腸道內(nèi)真菌、病毒等微生物對纖維的降解尚需深入研究。

4　結(jié)　論

5%和8%日糧纖維水平對卡洛斯鵝盲腸細(xì)菌Alpha多樣性無顯著影響，但可顯著影響Verrucomicrobia、Deferribacteres、Synergistetes、Euryarchaeota菌門以及Desulfovibrio、Prevotella、Helicobacter、Mucispirillum、Akkermansia、Bacteroides、Methanobrevibacter菌屬的相對豐度。

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