姚焱彬，陳　章，儲霞飛，魏建忠，孫　裴，李　郁

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌，為格拉瑟氏病(Gl?sser′s disease)的病原菌。隨著養(yǎng)豬集約化程度的提高以及飼養(yǎng)條件和飼養(yǎng)管理的改變，由HPS引起的以豬纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎、腦膜炎、呼吸困難、高熱及高死亡率為特征的傳染性疾病呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，并已成為世界范圍的一種嚴重的細菌性傳染病[1-2]。目前針對Gl?sser′s病的防控措施主要是應用抗菌藥物和滅活疫苗。然而，隨著抗菌藥物的大量使用，甚至亂用或濫用，導致HPS的耐藥譜逐漸拓寬，多重耐藥現(xiàn)象日益嚴重[3]；同時由于HPS血清型眾多，各型菌株間的毒力或致病性差異都很大，且相互之間缺乏有效的交叉保護力，致使HPS滅活疫苗的保護效果十分有限[4-5]。

鐵是細菌生長代謝中不可缺少的元素，但宿主體內(nèi)是一種低鐵濃度的環(huán)境，鐵離子往往是與宿主糖蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等絡合在一起，致使細菌必須以某種機制來攝取鐵。目前已知的鐵調(diào)節(jié)蛋白包括6種：鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白、鐵結合蛋白、轉(zhuǎn)鐵結合蛋白(transferrin-binding protein，Tbp，包括TbpA和TbpB)、乳鐵結合蛋白及血紅素結合蛋白[6]。HPS 可利用轉(zhuǎn)鐵蛋白提供細菌生長必需的鐵離子[7]。N. Charland等已證明豬血清中Tbp受體的存在，并分析兩種Tbp的多肽結構分別是：TbpA 94～96 ku，TbpB 60 ku，也只能特異性結合豬的轉(zhuǎn)鐵蛋白[8]。2010年，S. Martínez等克隆表達了HPS血清5型tbpA基因中一段600 bp核苷酸序列，并證實該片段具有免疫原性[9]。2011年，本研究室辛偉等對血清型13型HPS 的tbpA基因分3段進行克隆表達，研究結果顯示三段重組蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3大小分別為62、54、44 ku)均具有良好的反應原性，其中rTbpA1更具有良好的免疫原性[10]。2012年，本研究室黃曉慧等進一步對血清型13型HPS的tbpA全基因進行原核表達，大小為110 ku的重組TbpA具有良好的免疫活性[11]。

在前期研究中，我們利用HPS血清型13型重組TbpA蛋白(110 ku)免疫豚鼠，結果顯示對豚鼠具有良好的免疫保護。當免疫蛋白量達到100 μg時，對血清型13型HPS的保護率高達80%，血清型4型攻毒后保護率為60%[12]。本試驗系在此研究基礎上，采用HPS血清型13型不同蛋白質(zhì)濃度的重組TbpA免疫仔豬，通過測定血清抗體(IgG)及細胞因子(IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α)水平，同時對免疫后仔豬進行同型菌株的攻毒，記錄攻毒后仔豬存活和死亡情況，觀察和比較病理學變化，結果表明血清型13型HPS的TbpA蛋白可為仔豬提供較好的免疫保護并能抵抗同一血清型菌株的攻擊，為下一步探究重組TbpA對本動物仔豬的免疫交互試驗奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　菌株和質(zhì)粒

HPS血清型13 型安徽分離菌株(HPS-LJ3)、重組質(zhì)粒pET-SUMO-tbpA、E.coilDH5α/Rosetta(DE3)菌株均由安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院傳染病實驗室保存。

1.2　試驗仔豬及試驗場地

14日齡及42日齡仔豬購自安徽浩翔農(nóng)牧科技有限公司，試驗場地由安徽東方帝維生物制品股份有限公司提供。

1.3　主要試劑

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、3,3″,5,5″-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、30%丙烯酰胺溶液、考馬斯亮藍 R250、β-巰基乙醇購自上海生工生物工程技術服務有限公司；新生小牛血清購自杭州四季青有限公司；含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)、含0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)、LB肉湯購自紹興天恒生物科技有限公司；Ni-NTA His Bind Purification Kit 購自 Novagen 公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris 堿)、弗氏完全佐劑、HRP標記山羊抗豬IgG(IgG-HRP) 購自SIGMA公司；細胞因子(IL-5、IL-10、IFN-γ和TNF-α)ELISA試劑盒購自美國 RB 公司。

1.4　重組TbpA的表達及純化

參照黃曉慧等[11]的方法，對重組TbpA進行表達和純化，具體方法如下：將重組質(zhì)粒pET-SUMO-tbpA轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆接種于含50 μg·mL-1Amp LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)(150 r·min-1)過夜。按1∶100將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至100 mL上述LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600 nm為0.6～0.8)。加入終濃度0.3 mmol·L-1的IPTG，20 ℃ 120 r·min-1過夜誘導表達。將誘導后菌液13 000 g離心5 min，棄上清，收集沉淀，5 mL 裂解液重懸沉淀后超聲破碎。10 000 g離心10 min收集沉淀即為包涵體。將包涵體復性后利用 Ni-his-resin純化蛋白質(zhì)，最后用500 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白質(zhì)，通過全波長多功能酶標儀測定純化后的蛋白質(zhì)濃度，并進行SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達及純化效果。

1.5　重組TbpA的Western blotting鑒定

純化后的重組TbpA用半干轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(15 V, 40 min),含5%脫脂奶粉的封閉液中4 ℃過夜。以兔抗HPS-LJ3株陽性血清(1∶400稀釋)為一抗，室溫搖床孵育1 h，洗膜后用帶HRP標記的山羊抗兔IgG (1∶5 000稀釋) 為二抗，室溫搖床孵育1 h，最后用DAB 顯色液試劑盒顯色。

1.6　篩選HPS抗體陰性健康仔豬

自前腔靜脈采集50頭42日齡左右的仔豬血液，采用黃曉慧(X.H.Huang)等建立的間接ELISA檢測方法[12]篩選出15頭HPS抗體陰性健康仔豬。

1.7　HPS-LJ3株LD50的測定

采用Reed-Muench法，將15頭HPS抗體陰性健康仔豬，隨機分為5組，每組3頭。第一組攻毒劑量為1011CFU·mL-1，依次進行10倍稀釋到第5組。腹腔攻毒后，觀察仔豬臨床癥狀并記錄死亡數(shù)量，同時對死亡仔豬進行細菌分離回收。將試驗死亡動物數(shù)和存活動物數(shù)進行累積相加和，再用加和的數(shù)據(jù)計算死亡率。距離比例r=(A-50)÷(A-B)(A為剛好死亡率大于50%；B為剛好死亡率小于50%)；lg LD50=高于50%死亡率稀釋度倒數(shù)的對數(shù)+距離比例×稀釋倍數(shù)的對數(shù)。

1.8　HPS-LJ3株滅活全菌體的制備及重組TbpA的乳化

1.8.1HPS-LJ3株滅活全菌體的制備挑取HPS單菌落接種于5 mL TSB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，將培養(yǎng)物1∶100轉(zhuǎn)接至新的TSB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h(菌落總數(shù)達1.5×109CFU·mL-1)，0.3%甲醛37 ℃滅活24 h。無菌檢驗合格后，與弗氏佐劑按照1∶1進行配比乳化。

1.8.2重組TbpA的乳化將重組TbpA與弗氏佐劑按照1∶1進行配比乳化，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9　重組TbpA和HPS-LJ3株滅活全菌體的免疫保護試驗

1.9.1免疫試驗25頭HPS抗體陰性健康仔豬，隨機分為5組(編號分別為A、B、C、D、E)，每組5頭(表1)。其中A、B組接種純化的重組TbpA，蛋白質(zhì)濃度分別為0.5和0.25 mg·4 mL-1，免疫劑量均為4 mL·頭-1；C組接種HPS-LJ3株滅活全菌體，免疫劑量為4 mL·頭-1；D組為攻毒對照組，E組為陰性對照組，均接種滅菌PBS，4 mL·頭-1。接種途徑均為頸部肌肉注射，共三次，每次間隔時間為14 d。第一次免疫接種使用弗氏完全佐劑，第二、三次均使用弗氏不完全佐劑。

表1試驗仔豬分組及免疫接種情況

Table1Groupingandvaccinationoftestedpiglets

組別Groups免疫接種類型Typeofimmunization劑量/(mL·頭-1)DoseA0.5mg·4mL-1的重組TbpA4B0.25mg·4mL-1的重組TbpA4CHPS-LJ3株滅活全菌體4D滅菌PBS(攻毒對照組)4E滅菌PBS(陰性對照組)4

1.9.2血清中IgG及細胞因子檢測自一免和二免14 d、三免10 d后，從前腔靜脈采集仔豬血液，靜置后離心分離血清，保存于-20 ℃。參考黃曉慧(X.H.Huang)等[12]建立的方法，檢測仔豬免疫后抗體水平，并按照細胞因子ELISA檢測試劑盒說明書進行細胞因子(IL-5、IL-10、IFN-α、TNF-γ)含量的測定。

1.9.3攻毒保護試驗三免10 d后，用7 LD50劑量的HPS-LJ3株對A、B、C、D組仔豬進行腹腔攻毒，E組注射等體積無菌PBS。攻毒后，連續(xù)14 d觀察仔豬的精神狀態(tài)、飲食欲及死亡情況，并按無菌操作從死亡仔豬的脾、肺、肝、腎中采樣，分別接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基(含有0.01%NAD和5%小牛血清)，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取可疑菌落進行涂片、染色鏡檢，并經(jīng)PCR鑒定。最終計算免疫保護率(免疫保護率=存活仔豬數(shù)/攻毒仔豬數(shù)×100%)。

1.9.4病理學檢查眼觀各組仔豬內(nèi)臟器官(心、脾、肺、肝、腎)的病理變化，同時采集肺和脾，制作石蠟切片，HE染色，鏡檢觀察組織病理學變化。

2　結　果

2.1　重組TbpA的誘導表達及純化

pET-SUMO-tbpA轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導產(chǎn)生大小約為110 ku的目的蛋白，經(jīng)Ni-his-resin純化的重組TbpA質(zhì)量濃度為 1 mg·mL-1(圖1)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. 純化前的TbpA；2～5. 純化后的TbpAM. Protein molecular weight marker; 1. Unpurified TbpA; 2-5. Purified TbpA 圖1　純化蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析Fig.1　SDS-PAGE analysis of purified protein

2.2　重組TbpA的Western blotting鑒定

純化的重組TbpA經(jīng)Western blotting 鑒定，在110 ku處出現(xiàn)明顯的條帶，而陰性對照無明顯條帶，表明表達的產(chǎn)物能夠與陽性血清發(fā)生抗原抗體特異性結合，具有良好的反應原性(圖2)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.純化的TbpA；2. 陰性對照M. Protein molecular weight marker; 1. Purified TbpA; 2. Negative control圖2　純化重組蛋白質(zhì)的Western blotting分析Fig.2　Western blotting analysis of purified recombinant protein

2.3　HPS-LJ3株LD50的測定

以劑量1011CFU·mL-1腹腔注射后，仔豬全部死亡；以劑量1010CFU·mL-1腹腔注射后，仔豬死亡2只；以劑量109CFU·mL-1腹腔注射后，仔豬死亡1只；以劑量108CFU·mL-1腹腔注射后，仔豬死亡1只；以劑量107CFU·mL-1腹腔注射后，仔豬全部存活。經(jīng)計算，HPS-LJ3株對仔豬的LD50為1.778·109CFU·mL-1。

2.4　重組TbpA和HPS-LJ3株滅活全菌體的免疫保護試驗

2.4.1IgG 檢測用不同劑量的重組TbpA和HPS-LJ3株滅活全菌體對仔豬進行了三次免疫。 A、B組在一免后HPS抗體水平與E組之間均差異不顯著(P>0.05)，而二免和三免后HPS抗體水平均顯著高于E組(P<0.05)。A、B組三免后HPS抗體水平均顯著高于二免抗體水平(P<0.05)，且兩組之間差異不顯著。C組一免、二免和三免后抗體水平顯著高于E組(P<0.05)。一免和二免后C組抗體水平顯著高于A、B組 (P<0.05)，三免后C組抗體水平與A組和B組之間差異大為縮小(圖3)。

A.0.5 mg·4 mL-1重組TbpA免疫；B.0.25 mg·4 mL-1重組TbpA免疫；C.HPS-LJ3株滅活全菌體免疫；E.滅菌PBS免疫對照。標注不同字母者表示差異顯著(P<0.05)A. 0.5 mg·4 mL-1 TbpA immunized group; B. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunized group; C. Inactivated HPS-LJ3 immunized group; E. PBS control. Bars with different letter are different significantly (P<0.05)圖3　仔豬免疫后血清中IgG抗體檢測Fig.3　Levels of IgG production to piglets after immunization

2.4.2細胞因子檢測在一免和二免后，A、B、C組的細胞因子IL-5、IL-10、IFN-γ、 TNF-α 水平與E組之間大部分時間點差異顯著(P<0.05)，而三免后，A、B、C組的細胞因子水平均顯著高于E組(P<0.05)(圖4)。

2.4.3攻毒保護試驗結果顯示，A、C組精神狀況良好，保護率均為100%；B組從3頭死亡仔豬的肺、脾分離到大量HPS，2頭存活仔豬則分離到少量HPS，保護率為40%； D組仔豬精神沉郁，死亡率100%，并從死亡仔豬的肺、脾分離到大量HPS；E組仔豬全部存活(圖5)。

2.4.4 病理學檢查

2.4.4.1大體病變：A、B、C、E組存活仔豬剖檢后均未見明顯病理變化。B組死亡仔豬后肢關節(jié)切開有積液，腕關節(jié)和跗關節(jié)腫大，觸摸有波動感，肺間質(zhì)水腫，肺兩側肺葉的尖葉、心葉、膈葉及副葉壞死，纖維素性滲出，胸腔黏連，胸外膜出血。脾出血、稍腫大，表面可見出血性梗死灶和大量纖維素性滲出物。腹腔黏連，有纖維素性滲出，腹水增多。腸系膜淋巴結及腹股溝淋巴結出血。D組死亡仔豬表現(xiàn)肺出血、壞死，纖維素性肺炎，脾邊緣壞死。

A.0.5 mg·4 mL-1重組TbpA免疫；B.0.25 mg·4 mL-1重組TbpA免疫；C.HPS-LJ3株滅活全菌體免疫；E.滅菌PBS免疫對照。*.P<0.05A. 0.5 mg·4 mL-1 TbpA immunized group; B. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunized group; C. Inactivated HPS-LJ3 immunized group; E. PBS control.*.P<0.05圖4　仔豬免疫后細胞因子水平變化Fig.4　Levels of cytokine production after immunization

A.0.5 mg·4 mL-1 TbpA免疫+攻毒；B.0.25 mg·4 mL-1TbpA免疫+攻毒；C.HPS-LJ3株滅活全菌體免疫+攻毒；D.攻毒對照組；E.PBS免疫不攻毒對照A. 0.5 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge; B. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge; C. Inactivated HPS-LJ3 immunization & challenge; D. HPS-LJ3 challenge group；E. PBS control圖5　免疫攻毒后仔豬存活情況Fig.5　Survival of immunized piglets following HPS challenge

2.4.4.2組織學檢查：取各組的HE染色石蠟切片，鏡檢。

肺：A組肺間質(zhì)有極少量炎性細胞、肺泡間隔增寬、肺小葉少量出血，有漿細胞和成纖維細胞。B組存活仔豬肺間質(zhì)有少量炎性細胞浸潤、肺小葉出血嚴重，肺泡內(nèi)有少量纖維素性滲出物；B組死亡仔豬肺泡間隔增寬，支氣管肺炎，肺間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，肺泡內(nèi)有滲出液和纖維素性滲出物，肺氣腫、邊緣塌陷，肺小葉嚴重出血，肺固有結構消失，有大量的紅細胞。C組肺間質(zhì)只有極少量炎性細胞，肺小葉輕微出血，有漿細胞、成纖維細胞生成。D組肺泡間隔增寬，支氣管肺炎、肺小葉出血，肺泡內(nèi)有纖維素性滲出物。E組沒有明顯病理變化(圖6)。

脾：A組無明顯病理變化。B組存活仔豬，脾小體有少量炎性細胞浸潤，紅髓區(qū)出血嚴重；B組死亡仔豬，脾小體淡染，大量炎性細胞浸潤，紅髓區(qū)和邊緣區(qū)嚴重出血，有大量紅細胞彌漫性分布。C組無明顯病理變化。D組脾小體淡染, 紅髓區(qū)出血，有大量炎性細胞。E組無明顯病理變化(圖7)。

a.0.5 mg·4 mL-1TbpA免疫+攻毒；b.0.25 mg·4 mL-1TbpA免疫+攻毒(存活)；c.0.25 mg·4 mL-1 TbpA免疫+攻毒(死亡); d.HPS-LJ3株滅活全菌體免疫+攻毒；e.攻毒對照組；f.PBS免疫不攻毒對照a. 0.5 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge; b. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge (alive); c. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge (dead); d.Inactivated HPS-LJ3 immunization & challenge; e. HPS-LJ3 challenge group；f. PBS control圖6　各組仔豬肺病理組織學檢查(HE 染色，40×)Fig.6　The histology of lung from piglets in various groups(HE staining，40 ×)

a.0.5 mg·4 mL-1TbpA免疫+攻毒；b.0.25 mg·4 mL-1TbpA免疫+攻毒(存活仔豬)；c.0.25 mg·4 mL-1 TbpA免疫+攻毒(死亡仔豬); d.HPS-LJ3株滅活全菌體免疫+攻毒；e.攻毒對照組；f.PBS免疫不攻毒對照a. 0.5 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge; b. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge; c. 0.25 mg·4 mL-1 TbpA immunization & challenge (dead); d.Inactivated HPS-LJ3 immunization & challenge; e. HPS-LJ3 challenge group；f. PBS control圖7　各組仔豬脾病理組織學檢查(HE染色，40 ×) Fig.7　The histology of lung from piglets in various groups (HE staining，40 ×)

3　討　論

近幾年，國內(nèi)關于Gl?sser′s病的報道越來越多，該病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，主要采用藥物治療和接種疫苗防控此病，但由于養(yǎng)殖場濫用抗生素等因素，使得 HPS 的耐藥譜逐年增加，產(chǎn)生大量的多重耐藥菌株[3]。易新建等和趙戰(zhàn)勤(Z.Q.Zhao)等雖研制了HPS三價(血清型4型、5型、12型)滅活疫苗，較傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，具有更高的免疫效力[13-14]，但由于HPS不同血清型菌株之間的致病力存在較大的差異，同時HPS各血清型菌株之間缺乏有效的交叉保護力[15]，此外，HPS具有明顯的地方性特征，相同血清型的不同地方分離株致病力也不盡相同[16-17]等原因，造成了滅活疫苗免疫效果的不確實。因此，篩選免疫保護性抗原，研制高效廣譜的HPS新疫苗是防控Gl?sser′s病的新途徑。目前已有的研究表明，HPS的外膜蛋白(OMPs)、TbpA、TbpB 等均可作為研制HPS亞單位疫苗的候選抗原，但迄今為止尚未見到這些蛋白質(zhì)免疫仔豬后能抵抗不同血清型HPS的報道[18-19]。本研究是在黃曉慧(X.H.Huang)等[12]研究基礎上，進一步探討了HPS血清型13型的TbpA對仔豬的免疫保護作用，TbpA不僅能誘導仔豬產(chǎn)生較好的免疫抗體水平，而且對同型HPS的攻擊具有較強的抵抗力，從而為后續(xù)進行TbpA免疫仔豬是否能夠抵抗不同血清型的HPS的感染，以及不同血清型HPS的TbpA可否使仔豬產(chǎn)生交叉免疫保護的研究奠定基礎。

抗原能否刺激機體產(chǎn)生免疫反應及產(chǎn)生免疫反應的類型，對于其能否作為有效的疫苗候選抗原起著至關重要的作用。IgG是動物自然感染和人工主動免疫后，機體所產(chǎn)生的主要抗體類型，是動物機體抗感染免疫的主力軍[20]。本研究對仔豬進行了三次免疫，與前二次免疫相比，三免后，A、B、C組均顯著誘導機體產(chǎn)生IgG，且其之間已很接近，表明重組TbpA與滅活全菌體免疫機體后均能產(chǎn)生良好的體液免疫反應。細胞因子表達水平的變化可以反映機體發(fā)生的免疫反應類型, Th1細胞分泌IFN-γ、TNF-α 和IL-2等，其中TNF-α 在機體發(fā)熱和炎癥的發(fā)生中起免疫調(diào)節(jié)作用[21]，可促進細胞免疫應答；Th2細胞分泌IL-5和IL-10等，其中IL-5可以促進B細胞分化與增長，誘導嗜酸性粒細胞分化[22]，可促進體液免疫應答。仔豬三免后，A、B、C組的細胞因子水平(IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α)均顯著高于E組，且其之間也無顯著差異，表明重組TbpA與滅活全菌體同樣能夠很好地誘導機體的Th1和Th2型免疫反應。

炎癥反應實質(zhì)上是一種以防御為主的病理過程。炎性細胞浸潤是炎癥反應的重要指征，炎性細胞在慢性炎癥中吞噬病原體和組織碎片并進行消化，引起組織和細胞的損傷。本研究中，攻毒菌株毒力較強，攻毒后仔豬均出現(xiàn)急性死亡，故攻毒對照組仔豬病理變化以出血為主，組織損傷不明顯。B組仔豬死亡時間比D組遲，內(nèi)臟出血比D組輕，但組織損傷較嚴重。B組存活仔豬內(nèi)臟也有一定程度的出血及組織損傷，但比死亡仔豬及D組仔豬輕。A、C組仔豬內(nèi)臟未見出血，僅有輕微組織損傷，兩組仔豬病理組織損傷差異不明顯?？梢姍C體在發(fā)揮免疫作用的同時，也會造成自身組織和細胞的損傷。炎癥痊愈的結局是機體溶解吸收炎性滲出物及壞死組織。本研究中，B組存活仔豬肺和脾有一定量的炎性細胞變性壞死，A、C組仔豬肺和脾只有少量炎性細胞并且發(fā)生變性壞死，均提示為炎癥的轉(zhuǎn)歸。機體對所形成組織損傷進行修補恢復的過程稱為修復，修復后可完全或部分恢復原組織的結構和功能。本研究中，B組存活仔豬有一定程度組織損傷，處于修復初始階段，A、C組仔豬組織損傷很輕微，可見已基本完成修復過程[23]。

抗體是由漿細胞產(chǎn)生，正常機體漿細胞存在于脾和淋巴結相應組織處，漿細胞產(chǎn)生抗體并釋放到周圍的組織液中。漿細胞具有合成、貯存抗體的功能，參與機體體液免疫反應。成纖維細胞為多突的紡錘形，核仁大而明顯。處于靜止狀態(tài)的纖維細胞，胞體較小，當在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可轉(zhuǎn)為功能活動旺盛的成纖維細胞，當機體受到損傷時，均會造成不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細胞增生和細胞間質(zhì)的形成來進行組織修復并參加細胞免疫，成纖維細胞在積極參加細胞免疫過程中有很重要的作用[24]。A組和C組的仔豬肺均出現(xiàn)漿細胞和成纖維細胞，表明對仔豬進行攻毒之后，重組TbpA(0.5 mg·4 mL-1)與滅活全菌體對仔豬均具有很好的免疫保護作用。

4　結　論

HPS血清型13型的TbpA能誘導仔豬產(chǎn)生免疫保護力，其中免疫劑量為0.5 mg·4 mL-1、免疫3次，對同型菌株的攻毒具有與免疫滅活全菌體相同的抵抗力，免疫保護率均為100%，這為進一步開展仔豬免疫血清型13型TbpA對不同血清型HPS的抵抗力，以及不同血清型HPS的TbpA誘導仔豬交叉免疫保護力的研究奠定了良好基礎。

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