王金玉，姜曉文，王　娜，王婕然，于苗苗，鐘　秋，于文會,2*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，哈爾濱 150030；2. 黑龍江省教育廳動物普通疾病防治重點實驗室，哈爾濱 150000)

豬鏈球菌是一種人畜共患菌，豬鏈球菌按莢膜抗原被分為33種血清型，其中豬鏈球菌2型是最常見、危害最大的，可以通過接觸直接傳染給人[1]。豬鏈球菌很容易在自然環(huán)境或動物體內(nèi)形成生物膜，使豬鏈球菌難以去除，增加了感染的危險性[2]。細菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)，是細菌或真菌特有的生命現(xiàn)象，主要是為了適應自然環(huán)境，有利于生存。當細菌在活組織或非活性組織表面吸附時，它們能夠分泌多種多糖復合物，如脂蛋白、纖維蛋白和多糖基質(zhì)，它們通過黏性物質(zhì)將細菌結合在一起，互相包裹纏繞形成的一種膜樣物質(zhì)[3-7]。已經(jīng)形成生物被膜的細菌比游離的細菌對抗生素的耐受力會增加到近1 000倍[8]。治療豬鏈球菌病的一個重要手段就是干預豬鏈球菌生物被膜的形成[9]。研究發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌中含有多種毒力基因，例如豬溶血素(SLY)、溶菌酶釋放蛋白(MRP)、莢膜多糖(CPS)、胞外因子(EF)、谷氨酸脫氫酶(GDH)等，均與致病性相關[10-17]。

大多數(shù)現(xiàn)有的抗菌劑是天然化合物，如青霉素、鏈霉素和β-內(nèi)酰胺類的提取物。由于耐藥細菌的大量出現(xiàn)，新的抗菌藥在市場上有很大的需求[18]。穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide，AG) 被譽為天然抗生素藥物，是一種二萜內(nèi)酯類化合物，爵床科植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm. f) Ness的全草或葉中的一種活性物質(zhì)，是穿心蓮的有效成分之一，AG 和它的衍生物具有抗炎、抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用，特別是在一些抗感染作用更加明顯，比如對細菌、真菌、病毒、原蟲等[19]。通過構建豬鏈球菌體外生物被膜模型，采用中藥單體穿心蓮內(nèi)酯對其進行干預，為豬鏈球菌病的細菌耐藥性尋找替代療法提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗菌株

豬鏈球菌2型分離株[20]，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，具有良好的生物被膜形成能力，菌種保存于含有20%甘油的THB 培養(yǎng)基中，-80 ℃保存。

1.2　培養(yǎng)基及試劑

THB(Todd-Hewitt broth)培養(yǎng)基購于高科園海博生物技術有限公司；犢牛血清購于四季青有限公司；結晶紫染料、瓊脂粉末、腦心浸液粉末均購于南京化學試劑有限公司；24孔及96孔細胞培養(yǎng)板購于美國Costar公司；穿心蓮內(nèi)酯標準品購于中國食品藥品檢定研究院。

1.3　穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌的MIC和MBC測定

向96孔細胞培養(yǎng)板依次加入用THB培養(yǎng)基稀釋的菌液，第1孔加入160 μL THB稀釋的菌液外，2～12孔每孔加入100 μL THB稀釋的菌液。向第1孔加入40 μL 5 mg·mL-1的穿心蓮內(nèi)酯溶液，混勻后采取二倍稀釋法逐一稀釋每孔中的藥物濃度至第11孔，并從第11孔吸取100 μL 棄去，第12孔為不加穿心蓮內(nèi)酯的陰性對照組。使每孔最終菌液濃度約為1×106cfu·mL-1。按上述方法做3組重復。于37 ℃培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察，無細菌生長為MIC[21]。從確定為MIC的孔到最后一孔中分別吸取50 μL的液體涂布法接種于THB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。接種平板中肉眼未見細菌生長的最低藥物濃度為MBC[22]。

1.4　豬鏈球菌生長曲線的測定

將活化好的豬鏈球菌用THB液體培養(yǎng)基稀釋到1×108cfu·mL-1，每個試管中加入一定量的THB培養(yǎng)基和穿心蓮內(nèi)酯，使菌液濃度為1×106cfu·mL-1，穿心蓮內(nèi)酯的濃度分別是1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、陰性對照組為不加藥物組，每個試管內(nèi)總體積為5 mL，每組3個重復。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，每小時取200 μL在600 nm處測定OD值，繪制生長曲線[23]。

1.5　菌落計數(shù)法觀察亞抑菌濃度的穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物被膜的影響

步驟：①將干凈的蓋玻片分割成合適的大小，放入無菌的錐形瓶中，分別放入10 mL含有1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC穿心蓮內(nèi)酯的培養(yǎng)基中，然后每孔中加入0.1 mL稀釋好的菌液，以不加穿心蓮內(nèi)酯的孔為空白對照組，37 ℃培養(yǎng)48 h；②取出培養(yǎng) 48 h生物膜模型，滅菌 PBS 輕輕沖洗兩次，去除浮游菌；錐形瓶中的菌液為懸浮菌組，兩組分別進行如下操作；③將生物膜模型置于盛有5 mL無菌THB 培養(yǎng)液的試管中，高速渦旋振蕩2 min，將細菌從玻璃片上振蕩下來形成懸液；④采用梯度稀釋法，分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7；⑤取0.1 mL 菌液到相應編號的THB平板中，垂直自流后置于37 ℃恒溫孵育箱培養(yǎng)24 h；⑥到達規(guī)定時間后選取菌落在30～300之間的平板計數(shù)。菌落數(shù)與對應稀釋倍數(shù)乘積即為原液細菌量，并換算成常用對數(shù)(gcfu·cm-2)。

1.6　亞MIC穿心蓮內(nèi)酯干預豬鏈球菌培養(yǎng)對生物被膜形成影響

取無菌的96孔板，同菌液濃度的豬鏈球菌放入含有1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC的96孔板中，以不加穿心蓮內(nèi)酯的孔為陰性對照組，氨芐西林抑制組為陽性對照，每組3個重復，培養(yǎng)72 h。然后將上層懸浮的豬鏈球菌吸走，用等量的無菌PBS清洗三次。再向每孔加入99%甲醇200 μL，固定15 min，晾干。每孔加入2%結晶紫200 μL染色5 min后，將染色液用無菌PBS沖洗掉。晾干，將結合染料的貼壁細菌及多糖等用33%冰醋酸200 μL溶解。用酶標儀(595 nm)測量OD值[24]。

1.7　RNA提取和定量RT-PCR

取處在對數(shù)生長期的豬鏈球菌100 μL，分別放入5 mL含有1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC穿心蓮內(nèi)酯的培養(yǎng)基中，在37 ℃的環(huán)境下進一步孵化72 h。陰性對照組培養(yǎng)基中不加穿心蓮內(nèi)酯。提取豬鏈球菌生物被膜的mRNA后用試劑盒進行cDNA的合成[25]。RT-PCR用來測量gdh、mrp、gapdh、sly、fbps、ef、cps2J和luxSmRNA 的轉(zhuǎn)錄量，16S rRNA為內(nèi)參基因。引物由上海生工設計并合成(表1)。準備20 μL PCR 預混液，包括12.5 μL 的IQ SYBR Green Supermix，1 μL的基因特異性引物(上下游引物總和)和6.5 μL的Rnase- and DNase-free water；最后加入5 μL 的cDNA。RT-PCR的反應條件：94 ℃ 10 min，以下進行35個周期：94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 20 s；72 ℃ 10 min[26]。

表1用于定量分析的引物

Table1Primersforquantitativeanalysis

基因Gene序列(5'-3')Sequence(5'-3')正向引物Forward反向引物ReversegdhACCTCTTGGCTTTGGTGGTTGAAGGATTTACCGTTTGCTGmrpTGGCACAGTTATCAAGGAACCTACCGTCAACACGAACCAATgapdhGCTGAAGAAGTAAACGCTGCTGTCGCATCAAACAATGAACCslyAGTCAGTTTGGCACTCGTAGGTTGTGGCTCGTAAGTCAAGCfbpsGCTCCTGACCACCTATCTGCTCAAAGCCACATCCAACTCAefGAACCCAAGGAACCAATCGAACATTCTGACCACTCGCATCcps2JTTGGAATACGCAGAGCAAGATAACCCTCCCGACAAATCACluxSCGAGTTTGGAAGAAATTGCAGAGCTGAATGAAGGCTGTGGT16SrRNATGCTAGTCACCGTAAGGCTAAGGGCTGCAAGATTTCCTTGAT

1.8　亞MIC穿心蓮內(nèi)酯干預豬鏈球菌生物被膜形態(tài)的觀察

步驟：①固定，將干凈的蓋玻片分割成合適的大小，放入無菌的24孔板中，分別放入含有2 mL 1/2MIC、1/4MIC和1/8MIC穿心蓮內(nèi)酯的培養(yǎng)基中，然后每孔中加入1 mL稀釋好的菌液，以不加穿心蓮內(nèi)酯的孔為空白對照組，37 ℃培養(yǎng)72 h后取出蓋玻片放入平皿中；用滅菌PBS洗滌兩次，放入戊二醛中固定，置4 ℃冰箱中1 h。②沖洗，用滅菌PBS洗去戊二醛，輕輕洗滌兩次，每次10 min。③脫水，用50%、70%、90%乙醇各脫水一次，每次10 min；用100%乙醇脫水2次，每次10 min。④置換，無水乙醇∶叔丁醇=1∶1，叔丁醇各1次，每次15 min。⑤干燥，將樣品放入-20 ℃冷凍室30 min，取出后放入冷凍干燥儀干燥4 h以上。⑥點樣，將制備好的樣品觀察面朝上，用導電膠帶粘附于掃描電鏡樣品臺上，進行標記、觀察。⑦鍍膜，用E-1010型離子溉射鍵膜儀，在真空條件下將樣品表面鍍一層厚150A的金屬膜；⑧觀察，將制備好的樣品粘在樣品臺上，掃描電鏡下進行觀察[27]。

1.9　AI-2的測定

將哈維氏弧菌接種于海生菌肉湯培養(yǎng)基中，于8 ℃ 120 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。600 nm測其OD值范圍在0.7～1.2均可。用新鮮的海生菌肉湯培養(yǎng)基以1∶5 000稀釋，隨后振蕩搖勻。用12孔板培養(yǎng)豬鏈球菌，第1孔加入2 mL含穿心蓮內(nèi)酯1 mg·mL-1的THB液體培養(yǎng)基，第2、3、4孔每孔加入1 mL普通THB培養(yǎng)基，從第1孔吸出1 mL加入到第2個孔依此類推，至第4孔吸出1 mL棄去，然后每孔加入1 mL普通THB培養(yǎng)基。第5孔加入2 mL普通THB培養(yǎng)基作為空白對照。最后每孔加入100 μL 稀釋好的豬鏈球菌。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。24 h后，將之前培養(yǎng)過的液體12 000 r·min-1，離心10 min，取上清液。將上述上清液放到試管中，以1∶9的體積比與哈維氏弧菌的稀釋菌液混合。每個試管做2組平行。28 ℃ 4 h搖床振蕩培養(yǎng)。4 h 后每個試管取出200 μL加入到黑色96孔酶標板內(nèi)，每個試管取三組做平行。熒光酶標儀測定其化學熒光[28]。

1.10　統(tǒng)計學處理

2　結　果

2.1　穿心蓮內(nèi)酯抗豬鏈球菌MIC和MBC測定

從表2可知穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.25 mg·mL-1，最低殺菌濃度(MBC)為0.5 mg·mL-1。

表2穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌的MIC和MBC

Table2MICandMBCofAndrographolideagainstStreptococcussuis

0.125mg·mL-10.25mg·mL-10.5mg·mL-11mg·mL-1MIC+---MBC++--

2.2　豬鏈球菌生長曲線

穿心蓮內(nèi)酯在1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC時對豬鏈球菌的生長無明顯抑制作用，試驗結果見圖1。

圖1　穿心蓮內(nèi)酯亞MIC濃度下豬鏈球菌的生長曲線Fig.1　Growth curve of Streptococcus suis at sub-MIC concentration of Andrographolide

2.3　菌落計數(shù)法觀察亞抑菌濃度的穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物被膜的影響

由表3可知在1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC時生物被膜中細菌數(shù)量明顯降低。

Table 3　 The number of Streptococcus suis supplement with sub-MIC concentration of Andrographolide gcfu·cm-2

2.4　亞MIC穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物被膜的干預作用

1/2MIC組、陽性對照與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)，1/4MIC、1/8MIC組與陰性對照組比較差異顯著(P<0.05)。穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌有干預作用呈劑量依賴性。試驗結果見圖2。

*. P<0.05，**. P<0.01圖2　亞MIC 濃度穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物被膜干預的作用Fig.2　Effect of sub-MIC concentration of Andrographolide on the biofilm of Streptococcus suis

2.5　RT-PCR檢測結果

如圖3所示，穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌的毒力因子gapdh、fbps、sly、ef、luxS的轉(zhuǎn)錄有抑制作用，在1/2MIC、1/4MIC時有顯著的抑制作用(P<0.05 或P<0.01)，1/8MIC時沒有明顯的抑制作用。

*. P<0.05，**. P<0.01圖3　穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌5種毒力因子轉(zhuǎn)錄影響測定結果Fig.3　Effect of Andrographolide on the transcription of 5 virulence factors of Streptococcus suis

如圖4所示，穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌的毒力因子cps2J、mrp、gdh的轉(zhuǎn)錄有促進作用，在1/2MIC、1/4MIC時有顯著的促進作用(P<0.05或P<0.01)，1/8MIC時沒有明顯的促進作用。

*. P<0.05，**. P<0.01圖4　穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌3種毒力因子轉(zhuǎn)錄影響測定結果Fig.4　Effect of Andrographolide on the transcription of 3 virulence factors of Streptococcus suis

2.6　亞MIC穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物被膜干預作用的形態(tài)學觀察

掃面電鏡結果顯示，不加藥物組中的細菌被鑲嵌在生物被膜中，周圍包裹著許多膜狀物質(zhì)，穿心蓮內(nèi)酯能夠使細菌周圍的膜狀物質(zhì)消失，細胞外基質(zhì)大量減少，細菌生物被膜發(fā)生明顯變化，細菌的數(shù)量明顯下降；穿心蓮內(nèi)酯對生物被膜的形成有抑制作用，且隨著劑量的增加這種抑制作用也隨之明顯增強，1/2MIC(圖5A)穿心蓮內(nèi)酯對生物被膜的干預作用最強，1/2MIC(圖5A)穿心蓮內(nèi)酯，1/4MIC(圖5B)穿心蓮內(nèi)酯，1/8MIC(圖5C)穿心蓮內(nèi)酯對生物被膜的干預作用依次減弱，圖5D為不加穿心蓮內(nèi)酯的陰性對照組。

2.7　AI-2的測定結果

使用哈維氏弧菌生物發(fā)光法測定細菌培養(yǎng)液中AI-2活性。AI-2活性測定表示為相對光單位和陰性組比較差異性。如圖6所示，1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC組與陰性對照組比較均有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)，說明穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌AI-2信號分子的產(chǎn)生有抑制作用，并且有劑量依賴性。

3　討　論

汪洋已經(jīng)研究出豬鏈球菌在體內(nèi)定植常以生物被膜形式生存，生物被膜可以阻止和抑制巨噬細胞、白細胞、抗體及抗生素進入生物被膜中清除或殺滅細菌，導致鏈球菌反復感染，難以控制[29]。從本研究中的豬鏈球菌對照組結晶紫染色結果可知，豬鏈球菌形成生物被膜的能力較強，在電鏡圖片中可看到豬鏈球菌被胞外基質(zhì)包繞，層層排布在菌體的周圍，形成塔型或蘑菇型的生物被膜[30]。如何能夠抑制或清除生物被膜，防止其反復感染已成為國內(nèi)、外學者關注的焦點。目前有研究結果表明十四、十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物對抑制細菌生物被膜形成有一定的作用[31]。本研究采用1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC濃度的穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物被膜形成進行干預，可見穿心蓮內(nèi)酯能夠有效抑制豬鏈球菌生物被膜的形成，這種抑制作用隨藥物劑量的增加而增強。這一結果與上文提到的結果相似。從掃描電鏡試驗結果可知，穿心蓮內(nèi)酯能使細菌生物被膜中的細菌數(shù)量和生物被膜的形態(tài)發(fā)生明顯變化，可見穿心蓮內(nèi)酯對生物被膜的干預作用確實存在劑量依賴性。

A. 1/2MIC穿心蓮內(nèi)酯；B. 1/4MIC穿心蓮內(nèi)酯；C. 1/8MIC穿心蓮內(nèi)酯；D.陰性對照A. 1/2MIC Andrographolide; B. 1/4MIC Andrographolide; C. 1/8MIC Andrographolide; D. Negative control圖5　掃描電鏡觀察亞MIC濃度穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌生物膜的形態(tài)學觀察(3 000×)Fig.5　Observation the effects of sub-MICs concentration of Andrographolide on the morphology of Streptococcus suis biofilm by scanning electron microscopy (3 000×)

*. P<0.05，**. P<0.01圖6　穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌AI-2的信號分子影響測定結果Fig.6　Effects of Andrographolide on Streptococcus suis AI-2 signals

已經(jīng)被證實了的早期豬鏈球菌經(jīng)典的毒力及與毒力相關的基因有CPS、MRP、IgG結合蛋白、GAPDH、分泌型核酸酶A、透明質(zhì)酸酶、EF、SLY、GDH、GDH、FBPS、精氨酸氨基肽酶、精氨酸氨基肽酶等。雖然對于豬鏈球菌的了解還不是非常的全面，但是經(jīng)過了前人20多年的研究，已經(jīng)鑒定出了一些公認的毒力基因及毒力的相關基因，在很大程度上提升了我們對于潛在毒力基因的認知度[10-12]。在相關研究報道中指出[29]，豬鏈球菌的毒力因子gapdh、sly、fbps、cps2J、mrp與豬鏈球菌的侵襲及黏附有關，從而能夠達到調(diào)節(jié)生物被膜形成的作用。本研究熒光定量PCR結果發(fā)現(xiàn)陰性對照組和加藥組相比，gapdh、sly、fbps、ef基因表達下調(diào)，而cps2J、mrp和gdh基因表達上調(diào)，并呈劑量依賴性。這說明穿心蓮內(nèi)酯有可能影響相關黏附基因的表達，從而抑制了豬鏈球菌生物被膜的形成。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)luxS基因表達下調(diào)，而且在使用哈維氏弧菌生物發(fā)光法測定細菌培養(yǎng)液中AI-2活性試驗時，我們發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯對豬鏈球菌AI-2信號分子的產(chǎn)生有抑制作用，并且有劑量依賴性。眾所周知[29]，luxS基因AI-2信號分子是調(diào)節(jié)密度感應系統(tǒng)的重要因子，密度感應系統(tǒng)(QS)是生物群體調(diào)節(jié)生命活動一種重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它可以使生物群體在達到一定的密度時調(diào)節(jié)諸如發(fā)光、產(chǎn)氣、耐藥及生物被膜形成等生命活動。在本研究中顯示，穿心蓮內(nèi)酯能夠下調(diào)表達luxS基因及抑制AI-2信號分子活性，說明穿心蓮內(nèi)酯能夠干預豬鏈球菌的QS系統(tǒng)，從而對豬鏈球菌生物被膜的形成產(chǎn)生了抑制作用。從以上結果我們發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯能很好地抑制豬鏈球菌形成生物被膜，并初步闡述其抑制的機制，然而豬鏈球菌生物被膜的產(chǎn)生和抑制機制還需要我們進一步的研究，希望本試驗可以為預防和治療豬鏈球菌病提供一些具體有意義的數(shù)據(jù)。

4　結　論

亞抑菌濃度的穿心蓮內(nèi)酯能夠干預豬鏈球菌生物被膜形成，并影響豬鏈球菌相關毒力基因及AI-2信號分子的表達。

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