卞　婷，周　磊，宋江偉，蓋新娜，郭　鑫，韓　軍，楊漢春

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是影響全球養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原[1-2]。PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，歸類(lèi)于套式病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬[3]。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(ICTV)最新的分類(lèi)顯示，動(dòng)脈炎病毒科有5個(gè)屬，PRRSV歸類(lèi)于豬動(dòng)脈炎病毒屬(Porartevirus)(https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/)。PRRSV基因組全長(zhǎng)約15 kb[4-5]，至少包含有12個(gè)開(kāi)放閱讀框(opening reading frames, ORFs)[6-7]。基于基因組序列及抗原特性的差異，PRRSV被分為兩大基因型，即歐洲型(基因1型)和北美洲型(基因2型)[8-10]，兩大基因型毒株間核苷酸相似性?xún)H為60%左右[11-12]。迄今為止，PRRSV感染及其造成的疫情仍未得到很好的控制，仍然在許多國(guó)家流行，尤其是變異或新毒株的出現(xiàn)經(jīng)常導(dǎo)致疫病的暴發(fā)和再流行[13-16]。

自20世紀(jì)90年代中期PRRSV在我國(guó)被確認(rèn)以來(lái)，已成為嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要病原之一[17]，尤其是2006年出現(xiàn)的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的廣泛流行給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15, 17]。近年來(lái)，基因2型PRRSV的類(lèi)NADC30毒株在我國(guó)出現(xiàn)[18-19]，并造成許多地區(qū)豬場(chǎng)PRRS疫情的暴發(fā)[19-21]。該類(lèi)毒株的非結(jié)構(gòu)蛋白2(Nsp2)編碼區(qū)存在與2008年美國(guó)分離株NADC30相同的缺失模式[22]，并且已有文獻(xiàn)報(bào)道該類(lèi)毒株與國(guó)內(nèi)高致病性毒株存在基因重組現(xiàn)象[23]。作為影響中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一類(lèi)新的PRRSV毒株，研究其致病機(jī)制為臨床疫情的控制提供依據(jù)顯得尤為重要，而反向遺傳操作技術(shù)是研究PRRSV變異與演化及分子致病機(jī)制的一個(gè)重要工具。因此，本研究旨在構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)室于2014年分離獲得的類(lèi)NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆，以期為深入研究該類(lèi)毒株的變異與演化以及與其他毒株致病性差異的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1病毒和細(xì)胞PRRSV 培養(yǎng)所需傳代細(xì)胞 MARC-145，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary alveolar macrophages，PAMs)從4周齡SPF仔豬肺泡灌洗液中獲得，保存于液氮中備用。類(lèi)NADC30毒株CHsx1401，分離于我國(guó)山西省某暴發(fā) PRRS 的豬場(chǎng)[19]，其全序組序列已測(cè)定并被GenBank(KP861625)收錄。

1.1.2載體和菌株pJET1.2克隆載體試劑盒購(gòu)于Fisher Scientific公司(Waltham, MA, USA)。改造后的 pWSK-29 低拷貝質(zhì)粒，用于全長(zhǎng)感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli) Trans10、DMT 感受態(tài)購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要試劑KOD 高保真 PCR 擴(kuò)增酶購(gòu)于東洋紡上海生物科技有限公司；GIBCOTMOpti-MEM?I Reduced Serum Medium、GIBCOTMRPM/MINI 1640與GIBCOTMDMEM以及 Lipofectamine LTX and plus reagents均購(gòu)自Fisher Scientific公司；DNA/RNA 提取試劑盒、dNTPs、TIANamp DNA/RNA kit、Fast Site-Directed Mutagenesis Kit 點(diǎn)突變?cè)噭┖屑?Trans15K Marker均購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒 Wizard?Plus Midipreps DNA Purification System、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和 T4 DNA 連接酶均購(gòu)于 Promega公司(Madison, WI, USA)；DNA 瓊脂糖膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；所有限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)于NEB公司(北京，中國(guó))。PRRSV N蛋白單克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗小鼠 IgG購(gòu)自中杉金橋生物有限公司(北京，中國(guó))。

1.2　方法

1.2.1PRRSV CHsx1401基因組片段cDNA的擴(kuò)增基于PRRSV CHsx1401的全基因組序列，將其基因組分為四個(gè)片段(A、B、C、D)，分別設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物(表1)。取200 μL PRRSV CHsx1401 F8代病毒液，用DNA/RNA 提取試劑盒提取病毒RNA，將提取的病毒基因組RNA分別用設(shè)計(jì)的擴(kuò)增各片段的下游引物AR、BR、CR、DR進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1擴(kuò)增PRRSV基因組cDNA片段和回復(fù)突變所用引物

Table1PrimersusedforamplificationofcDNAfragmentsofPRRSVgenomeandreversemutations

引物aPrimer位置bPosition序列(5'-3')cSequence長(zhǎng)度/ntLengthAF1-24GGCGCATTTAAATACCGTCTATGACGTATAGGTGTTGGCTCTA(SwaⅠ)3156AR3126-3156GCGGCGCACCGGTGTGTGGGGCATCATCACAAACCCG(SgrAⅠ)BF3149-3175GGCGCATTTAAATAGCCACCGGTGCTCTCTGTAGGTGCGGAGA(SwaⅠ,SgrAⅠ)4164BR7288-7312CGGCTAGCAGTTTAAACACTGCTCCTT(NheⅠ)CF7307-7330CTAGCTAGCCGCCAGCGGCTTGACCCG(NheⅠ)4283CR11562-11589TTTCTGGCGCGCCCGAAACGCTTCATTGTAATC(AscⅠ)DF11582-11612TTTCGGGCGCGCCAGAAAGGGAAGATTTATAGAGCC(AscⅠ)3498DR14990-15021GCGCGCCTTAATTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTAATTTCGGCCGCATGGTTCTCGCCAATTAAAT(PacⅠ)A-Mu-F2819-2848GCTGCTCTTTGTCGAGCGTAGAGATCACAC6130A-Mu-R2809-2838TACGCTCGACAAAGAGCAGCTTGATGACACB-Mu-F3714-3743TGTTGGTTTGTTCAAGCCTGTATCCGACCC7138B-Mu-R3704-3733CAGGCTTGAACAAACCAACAGCAAAAGCCAC-Mu-F8555-8584TTGTGCTGAGGATCACCTACCGTCGTATGT7257C-Mu-R8545-8574GTAGGTGATCCTCAGCACAAGCAAGCTCATD-Mu-F12076-12104AGCGAGGCCACGCTGTCTCGCATTAGTAG6472D-Mu-R12065-12094GAGACAGCGTGGCCTCGCTCACCACCTGTT

a. F表示上游引物，R表示反轉(zhuǎn)錄引物或下游引物，Mu表示回復(fù)突變所用引物；b. 數(shù)字表示在CHsx1401(KP861625)基因組中的位置；c. 括號(hào)中加下劃線(xiàn)部分表示由PCR引入的限制性?xún)?nèi)切酶，加粗字母表示回復(fù)突變的核苷酸

a. F represents a forward PCR primer, R represents reverse transcription or a reverse PCR primer, Mu represents the primers used for reverse mutations;b. Numbers refer to the nucleotide position within the genome of CHsx1401 (GenBank accession No. KP861625);c.Restriction enzyme sites introduced by PCR are underlined and indicated in parenthesis. The letters in boldface show the reverse mutated nucleotides

1.2.2全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建策略參照先前PRRSV感染性克隆構(gòu)建的策略和方法[24]，構(gòu)建CHsx1401毒株的全長(zhǎng)cDNA克隆。在低拷貝質(zhì)粒pWSK-29中插入CMV啟動(dòng)子和丁型肝炎病毒核酶，將CHsx1401全長(zhǎng)分為四個(gè)片段，在A(yíng)片段5′端加入SwaⅠ酶切位點(diǎn)，在A(yíng)片段的3′端及B片段的5′端加入SwaⅠ和SgrAⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)在D片段 3′末端加入Ploy(A)和PacⅠ酶切位點(diǎn)(表1)。利用PCR方法將CHsx1401基因組11582位處T同義突變?yōu)镚引入一個(gè)全長(zhǎng)單一酶切位點(diǎn)AscⅠ,該酶切位點(diǎn)既可以用于連接C和D片段，又可以作為拯救病毒的遺傳標(biāo)記(圖1)。RT-PCR擴(kuò)增各片段后分別連接至pJET1.2載體，構(gòu)建中間質(zhì)粒，測(cè)序無(wú)誤后通過(guò)各片段兩端的酶切位點(diǎn)將片段切下后按 DCBA 的順序依次連接到 pWSK-29，構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒。

圖1　pWSK-CHsx1401構(gòu)建策略Fig.1　Construction strategy of pWSK-CHsx1401

1.2.3中間質(zhì)粒的構(gòu)建PRRSV CHsx1401基因組中擴(kuò)增片段產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后回收目的條帶，將回收產(chǎn)物連接至pJET1.2載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑選菌落進(jìn)行PCR鑒定，將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆，送公司測(cè)序。如果存在突變點(diǎn)，則使用Fast Site-Directed Mutagenesis Kit 點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行回復(fù)突變。

1.2.4全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序鑒定用兩端的PacⅠ和AscⅠ將連接于pJET1.2載體上的D片段切下，再經(jīng)T4連接酶連于pWSK29載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細(xì)胞，用D片段引物 DF 和 DR 鑒定選取陽(yáng)性克隆接種含有200 mL LB/Amp+培養(yǎng)基，28 ℃ 150 r·min-1搖振培養(yǎng)20 h后，提取質(zhì)粒。C片段的酶切以及連接方法與D片段方法相同。由于B片段插入的兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶的反應(yīng)條件不同，需分別進(jìn)行單酶切后再連接到已構(gòu)建好的pWSK29-SDC載體中。A片段與B片段相似，同樣需分別進(jìn)行單酶切后再連入已構(gòu)建好的pWSK29-SDCB載體中，最后對(duì)構(gòu)建好的陽(yáng)性克隆進(jìn)行全基因組測(cè)序以確保序列的準(zhǔn)確性。

1.2.5病毒拯救及鑒定將生長(zhǎng)旺盛的MARC-145細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，以約 106·mL-1的細(xì)胞濃度培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL。置于含有 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用LTX脂質(zhì)體將全長(zhǎng)cDNA克隆轉(zhuǎn)染至MARC-145細(xì)胞，96 h后收取全部細(xì)胞培養(yǎng)液置于-80 ℃，反復(fù)凍融2次后在MARC-145細(xì)胞連續(xù)傳代2次。用間接免疫熒光和RT-PCR及序列測(cè)定對(duì)P3代拯救病毒進(jìn)行鑒定。

1.2.6體外增殖動(dòng)態(tài)按常規(guī)方法，將親本病毒與拯救病毒按MOI為0.01分別接種MARC-145細(xì)胞和PAMs，分別于感染后12、24、36、48、60、72、84 h收取細(xì)胞培養(yǎng)液，測(cè)定病毒TCID50。

2　結(jié)　果

2.1　PRRSV NADC30-like毒株CHsx1401基因組片段的擴(kuò)增及中間質(zhì)粒的構(gòu)建

用表1中設(shè)計(jì)的擴(kuò)增 CHsx1401 全基因組的四個(gè)片段相應(yīng)引物，將病毒基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用高保真酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，依次獲得病毒基因組的A、B、C 和D 四個(gè)擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小(分別為3 156、4 164、4 283和3 498 bp)相符(圖2)。在A(yíng)片段5′端加入SwaⅠ酶切位點(diǎn)，在A(yíng)片段的3′端及B片段的5′端加入SwaⅠ和SgrAⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)在D片段3′末端加入Ploy(A)和PacⅠ酶切位點(diǎn)。在C 片段3′端使用 PCR 進(jìn)行同義突變引入一個(gè)單一酶切位點(diǎn)AscⅠ，用于C、D 片段的連接和區(qū)分親本病毒與拯救病毒的遺傳標(biāo)記。A、B、C、D 四個(gè)片段的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切取相應(yīng)大小的片段，膠回收后連接到平末端克隆載體pJET1.2，分別構(gòu)建出中間質(zhì)粒pJET-A、pJET-B、pJET-C和pJET-D。對(duì)各中間質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定發(fā)現(xiàn)各片段均有由PCR擴(kuò)增非特異性引入的1個(gè)突變點(diǎn)，分別為nt2838位的A突變?yōu)镚，nt3733位的G突變?yōu)锳，nt8574位C突變?yōu)門(mén)和nt12094位C突變?yōu)門(mén)。利用表1中設(shè)計(jì)的引物以及點(diǎn)突變?cè)噭┖?，?duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行回復(fù)突變。

圖2　NADC30-like CHsx1401全基因組片段RT-PCR擴(kuò)增Fig.2　Amplification of four fragments of NADC30-like CHsx1401 genome by RT-PCR

2.2　CHsx1401全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建

將改造后的低拷貝質(zhì)粒pWSK29和pJET-D分別進(jìn)行AscⅠ/PacⅠ雙酶切，回收相應(yīng)片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)后，用D片段擴(kuò)增引物 DF/DR對(duì)菌落進(jìn)行 PCR 鑒定，選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，質(zhì)粒命名為pWSK-SD。將 pWSK-SD和pJET-C分別進(jìn)行NheⅠ/AscⅠ雙酶切，回收相應(yīng)片段，轉(zhuǎn)化后用PCR篩選陽(yáng)性克隆，再經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，獲得質(zhì)粒pWSK-SDC。用相同方法依次連接B片段和A片段，最終構(gòu)建出CHsx1401 的全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒 pWSK-SDCBA，全長(zhǎng)質(zhì)粒經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證正確后，命名為 pWSK-CHsx1401。

2.3　病毒拯救及鑒定

將全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒pWSK-CHsx1401轉(zhuǎn)染MARC-145 細(xì)胞，并傳代。結(jié)果表明，第二代即可觀(guān)察到典型的 PRRSV 細(xì)胞病變(CPE)，拯救病毒命名為RvCHsx1401。將拯救病毒 P3 代接種96孔培養(yǎng)板的 MARC-145 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后用預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定，用 PRRSV N蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果表明，拯救病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)特異性熒光染色(圖3)。將 P3 代拯救病毒培養(yǎng)上清進(jìn)行 RT-PCR及測(cè)序鑒定，確證了遺傳標(biāo)記的存在。

圖3　拯救病毒的免疫熒光鑒定Fig.3　Identification of the rescued virus by indirect immunofluorescence assay

2.4　拯救病毒全基因組序列測(cè)定

對(duì)P3代拯救病毒的全基因組序列進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，拯救病毒RvCHsx1401的基因組序列無(wú)堿基突變，與親本病毒序列相似性為100%。

2.5　拯救病毒傳代穩(wěn)定性鑒定

將拯救病毒在MARC-145細(xì)胞上連續(xù)傳10代，對(duì)3、5、7、9和10代病毒的滴度進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，拯救病毒均可在MARC-145細(xì)胞上穩(wěn)定傳代，毒價(jià)介于105～107.5TCID50·mL-1。同時(shí)對(duì)各代病毒的遺傳標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行測(cè)序分析，顯示遺傳標(biāo)記穩(wěn)定存在，未發(fā)生突變。

2.6　拯救病毒體外增殖特性

在MARC-145及原代PAMs上的生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示(圖4)，拯救病毒RvCHsx1401的增殖動(dòng)態(tài)與親本病毒CHsx1401相似，僅在MARC-145細(xì)胞上各時(shí)相的病毒滴度略低于親本病毒，但無(wú)顯著性差異。

3　討　論

反向遺傳操作技術(shù)即感染性克隆技術(shù)，是研究RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)與基因功能以及致病機(jī)制必不可少的技術(shù)平臺(tái)。PRRSV作為一種影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要RNA病原，其感染性克隆技術(shù)已廣泛應(yīng)用于其基因功能、復(fù)制及分子致病機(jī)制等多個(gè)領(lǐng)域的研究[24-26]。

圖4　拯救病毒在MARC-145細(xì)胞(A)和原代PAM(B)上的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4　Growth curves of the rescued virus RvCHsx1401 in MARC-145 cells (A) and in primary PAMs (B)

PRRSV嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)，其變異與演化快速，毒株多樣性不斷攀升，新毒株以及重組毒株出現(xiàn)的頻率持續(xù)增高[27]。近幾年，屬于基因2型譜系1的類(lèi) NADC30 毒株在我國(guó)廣泛流行，成為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行毒株之一。最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，無(wú)論豬場(chǎng)免疫何種減毒活疫苗，一旦受到該毒株感染，豬群均會(huì)發(fā)病[28]。已有研究表明，類(lèi)NADC30毒株CHsx1401對(duì)仔豬具有中等毒力，感染仔豬呈現(xiàn)體溫升高、呼吸道癥狀和肺組織病變，且目前使用的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫均不能有效抵抗該毒株的感染[29]。此外，該毒株與我國(guó)其他毒株以及疫苗病毒頻繁重組[30]，加劇了PRRSV的防控難度。顯而易見(jiàn)，類(lèi)NADC30毒株的致病性不同于我國(guó)基因2型譜系8的高致病性毒株，且差別很大。因此，研究該類(lèi)毒株的致病機(jī)制以及與我國(guó)毒株致病性差異的分子機(jī)制十分必要，同時(shí)分析其與我國(guó)毒株的重組特性與分子機(jī)制對(duì)于我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中PRRSV感染的控制有重要的意義。

本研究成功構(gòu)建出類(lèi)NADC30代表性毒株CHsx1401的感染性cDNA克隆，且拯救出與親本毒體外增殖動(dòng)態(tài)基本一致、傳代穩(wěn)定的克隆病毒。我們將進(jìn)一步利用類(lèi)NADC30毒株的感染性cDNA克隆，與我國(guó)高致病性毒株進(jìn)行基因片段的置換，構(gòu)建嵌合病毒，進(jìn)而分析相關(guān)基因在不同毒株間致病性差異方面的作用和生物學(xué)意義。

4　結(jié)　論

成功構(gòu)建出PRRSV類(lèi)NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆，拯救病毒的體外增殖特性與親本病毒基本一致，為進(jìn)一步研究該毒株的變異與演化以及致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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