李錄克，時艷榮，趙文華

平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院血液科，河南 平頂山4670000

多發(fā)性骨髓瘤，又稱骨髓瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、Kaher病，是一種來源于漿細(xì)胞的惡性腫瘤[1]，是因骨髓原始漿細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致的疾病，具有較高的發(fā)病率和病死率[2‐4]。多發(fā)性骨髓瘤是最為常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是目前仍不可治愈的一種疾病。硼替佐米（bortezomib）是一種新型抗腫瘤藥物，獲美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市[5]，用于難治性、復(fù)發(fā)性、多發(fā)性骨髓瘤的治療[6‐7]，目前仍是多發(fā)性骨髓瘤的首選治療藥物。但隨著硼替佐米在臨床中的長期使用，其治療多發(fā)性骨髓瘤的效果越來越不理想，追其原因是由于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對硼替佐米產(chǎn)生了高度耐藥性使其復(fù)發(fā)[8]，其作用機(jī)制迄今仍不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過對骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226進(jìn)行體外培養(yǎng)，并采用增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞Wnt/β‐catenin 信號通路相關(guān)蛋白β‐catenin 和 c‐myc及PⅠ3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白Bcl‐2和Bax的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤的調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collec‐tion，ATCC）；硼替佐米購自西安楊森制藥有限公司；10%胎牛血清購自浙江四季青公司；RPMⅠ1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MTT和DMSO購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海艾睿生物Gibco公司；Trizol購自上海Ⅰnvitrogen公司。RNA PCR Kit Ver.3.0、SYBR Premix Ex TaqⅡ和 Annexin V‐FⅠTC/PⅠ試劑盒購自德國 Bender公司；Western Blot試劑盒購自美國KPL公司；酶標(biāo)儀購自上海BⅠO‐TEK公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；β‐actin、β‐catenin、c‐myc、Bcl‐2和 Bax 鼠抗人一抗多克隆抗體購自上海Santa Cruz公司；兔抗鼠二抗多克隆抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。低溫高速離心機(jī)和二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（GBB‐16）均購自上海Heraeus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMⅠ1640培養(yǎng)基中進(jìn)行多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226的懸浮培養(yǎng)。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后換液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用MTT法檢測RPMⅠ8226細(xì)胞的增殖能力。將上述培養(yǎng)的對數(shù)期細(xì)胞濃度調(diào)至每孔5×103/ml后接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種100 μl。設(shè)5個處理組，分別加入終濃度為20、40、60、80及100 nmol/L的硼替佐米，每組設(shè)置3個復(fù)孔，以不含硼替佐米的細(xì)胞作為對照組，以空白孔調(diào)零，培養(yǎng) 24 h，每 孔 加 入 MTT 100 μl作 用 4 h，加 入DMSO 100 μl孵育30 min。在酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度A值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率=（[A對照組－A處理組）（/A對照組－A空白組）]×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

設(shè)硼替佐米濃度分別為20、40、60、80和100nmol/L的5個處理組和1個不含硼替佐米的對照組，取對數(shù)期生長的細(xì)胞，分別處理24 h采用后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌，離心。取100 μl細(xì)胞懸浮液加入5 μl Annexin V‐FⅠTC和5 μl PⅠ，置于室內(nèi)避光處理15 min。按照Annexin V FⅠTC/PⅠ試劑盒說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.5 β-catenin、c-myc、Bcl- 2和Bax mRNA表達(dá)

處理24 h后，收集各組細(xì)胞于1.5 ml離心管中，加入1 ml Trizol，提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄過程按照RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系25 μl，在熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，于2%瓊脂糖凝膠中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠成像觀察、照相。使用Gel‐pro Analyzer軟件進(jìn)行灰度分析，以灰度反映mRNA的表達(dá)量，以β‐actin為內(nèi)參，mRNA的相對含量=目的基因條帶灰度值/內(nèi)參基因條帶灰度值，每組重復(fù)3次，計(jì)算平均值。各基因的引物序列，詳見表1。

表1 各基因的引物序列

1.6 WesternBlot法檢測蛋白表達(dá)

收集經(jīng)0、20、40、60、80和100 nmol/L硼替佐米處理24 h后的RPMⅠ8226細(xì)胞，置于1.5 ml的離心管中，經(jīng)PBS洗滌，充分裂解后，離心，提取總蛋白。其中以0 nmol/L的硼替佐米為對照組，其他為處理組。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，封閉，特異性一抗（鼠抗人 c‐myc、β‐catenin、Bcl‐2、Bax 和β‐actin 抗體）4℃孵育過夜。然后室溫二抗（兔抗鼠）反應(yīng)1 h，ECL顯色，顯影，定影。以β‐actin為內(nèi)參，計(jì)算各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD‐t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硼替佐米對RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用

與對照組（0 nmol/L硼替佐米）相比，不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞增殖抑制率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且細(xì)胞增殖抑制率隨硼替佐米濃度的增加而增大，詳見圖1。經(jīng)計(jì)算，硼替佐米的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentra‐tion，ⅠC50）為31.95 nmol/L。

圖1 不同濃度的硼替佐米對RPMⅠ8226細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 硼替佐米對RPMI8226細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用

不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞凋亡率分別為（11.80±0.56）%、（19.45±1.25）%、（36.82±2.26）%、（43.56±3.50）%和（56.62±5.02）%，均高于對照組的（8.02±0.45）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 硼替佐米對RPMⅠ8226細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用

2.3 硼替佐米對 β-catenin、c-myc、Bcl- 2 和 Bax mRNA表達(dá)水平的影響

處理組c-myc、β-catenin和Bcl-2mRNA的表達(dá)水平低于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而下降；而BaxmRNA的表達(dá)水平高于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而升高。（表2）

2.4 硼替佐米對 β-catenin、c-myc、Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

處理組β‐catentin、c‐myc和Bcl‐2蛋白的表達(dá)水平低于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而下降；而Bax蛋白的表達(dá)水平高于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而升高。（圖3、表3）

表2 不同濃度的硼替佐米處理后各基因的mRNA表達(dá)水平（± s）

表2 不同濃度的硼替佐米處理后各基因的mRNA表達(dá)水平（± s）

注：與對照組比較，P＜0.05

組別對照組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μl/L 80 μmol/L 100 μmol/L 2.48±0.52 2.02±0.28 1.86±0.31 1.54±0.25*1.12±0.32*0.86±0.18*2.72±0.46 2.26±0.53 1.75±0.38*1.20±0.44*0.92±0.22*0.63±0.23*1.82±0.38 1.28±0.25 0.96±0.30*0.52±0.15*0.31±0.20*0.18±0.16*1.36±0.11 1.52±0.32 1.84±0.24*2.18±0.36*2.62±0.26*2.91±0.42**c‐mycβ‐cateninBcl‐2Bax

圖3 硼替佐米對 β‐catenin、c‐myc、Bcl‐ 2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

表3 不同濃度的硼替佐米處理后各蛋白的表達(dá)水平（± s）

表3 不同濃度的硼替佐米處理后各蛋白的表達(dá)水平（± s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L 100 μmol/L c‐myc 1.41±0.38 1.06±0.26 0.88±0.31*0.46±0.23*0.25±0.12*0.08±0.05*β‐catenin 1.26±0.23 1.12±0.18 0.92±0.12 0.76±0.16*0.58±0.10*0.18±0.22*Bax 0.76±0.23 0.83±0.15 0.90±0.11 0.99±0.20 1.03±0.28 1.15±0.35*Bcl‐2 1.21±0.32 0.96±0.16 0.85±0.24 0.66±0.25*0.42±0.16*0.20±0.07*

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)于65歲左右的老年人，發(fā)病率與性別無關(guān)，隨著社會老齡化的進(jìn)展，多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病率呈逐年增加趨勢[4,9]。多發(fā)性骨髓瘤的主要特征是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增殖，分泌片段或單克隆免疫球蛋白，伴有廣泛的感染、貧血、腎功能損害及溶骨病變等臨床表現(xiàn)[10]。多發(fā)性骨髓瘤的治療包括初始治療、干細(xì)胞移植（stem cell transplantation，SCT）、維持治療和復(fù)發(fā)的治療。目前，多發(fā)性骨髓瘤的病因和發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚。針對多發(fā)性骨髓瘤的難治、復(fù)發(fā)等情況，大多采用聯(lián)合用藥方案[11‐14]，但均以硼替佐米為主，硼替佐米是26S蛋白酶體抑制劑，通過阻斷細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控細(xì)胞凋亡及信號傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)的降解，以及多個通路發(fā)揮著抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測硼替佐米對骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226的增殖抑制作用，與對照組相比，不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞增殖抑制率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且細(xì)胞增殖抑制率隨硼替佐米濃度的增加而增大，呈劑量效應(yīng)。不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。處理組 c‐myc、β‐catenin 及Bcl‐2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而下降；而Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而升高。

研究表明，Wnt/β‐catenin信號通路中c-myc和β-catenin基因的異常變化與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[15]。硼替佐米通過抑制NF‐?B信號通路中Bax和Bcl‐2的活性阻止多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展[8]。這說明，在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，Wnt/β‐catenin和NF‐κB信號通路發(fā)揮重要作用。孫紅生[16]在研究硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制中也得出，硼替佐米可誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡，抑制Wnt/β‐catenin信號通路可能是其作用機(jī)制之一。研究已證實(shí)聯(lián)合用藥可提高多發(fā)性骨髓瘤的療效[17]，聯(lián)合用藥的作用機(jī)制不盡相同，了解硼替佐米對骨髓瘤的作用機(jī)制是尋找最好、最有效的治療方案的前提，而其對骨髓瘤細(xì)胞的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步更深入的研究。

綜上所述，硼替佐米可抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，作用機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β‐catenin和PⅠ3K/AKT信號通路有關(guān)。

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