施開創(chuàng)，覃　勇，尹彥文，唐云姣，黃百花

（1. 廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧　530001；2. 百色市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西百色　533000）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）、豬瘟（Classical swine fever，CSF）、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS）是當(dāng)前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病。2017年前，我國對FMD、CSF和HP-PRRS實行強(qiáng)制免疫，2017年后只對FMD實行強(qiáng)制免疫，而對CSF和HP-PRRS實行全面免疫[1]。為提高免疫效果，許多學(xué)者開展了FMD、CSF、HP-PRRS疫苗不同免疫程序的免疫效果研究[2-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在原有“333法”免疫程序（即FMD、CSF、HP-PRRS疫苗先后間隔14 d免疫注射）基礎(chǔ)上開展的“332法”（即先用FMD滅活疫苗和CSF弱毒疫苗同時在頸部分點免疫注射，間隔14 d后再用HP-PRRS弱毒疫苗免疫注射）和“321法”免疫程序（即將HP-PRRS弱毒疫苗和CSF弱毒疫苗釋稀后混合為一針，將FMD滅活疫苗單獨為一針分別在頸部兩側(cè)同時分點注射）均有更好的免疫效果[8]，且“321法”優(yōu)于“332法”[9-10]。本研究在小規(guī)模試驗基礎(chǔ)上，于2014—2016年在廣西省百色市12個縣（市、區(qū)）135個鄉(xiāng)鎮(zhèn)進(jìn)行了3種不同免疫程序的較大規(guī)模臨床試驗，以便為臨床大面積推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　疫苗

所使用疫苗為2014—2016年廣西政府招標(biāo)采購疫苗。FMD O型滅活疫苗（OMYA98/BY/2010株）：中農(nóng)威特生物科技股份有限公司、內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司、新疆天康生物科技股份有限公司生產(chǎn)；CSF弱毒疫苗（細(xì)胞源）：成都天邦生物制品有限公司、廣西麗原生物股分有限公司生產(chǎn)；HP-PRRS弱毒疫苗（TJM-F92株）：吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司、新疆天康生物科技股份有限公司生產(chǎn)。每年均用同一廠家生產(chǎn)的疫苗。

1.2　主要試劑

FMD O型抗體液相阻斷ELISA試劑盒：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所產(chǎn)品；豬瘟（CSF-Ab）抗體檢測試劑盒：韓國金諾公司產(chǎn)品；豬繁殖與呼吸綜合征抗體ELISA檢測試劑盒：法國LSI公司產(chǎn)品；口蹄疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒：北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3　試驗設(shè)計

免疫方式以春季、秋季集中免疫為主，常年定期補(bǔ)免為輔。2014—2016年在廣西百色市12個縣（市、區(qū)）135個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，根據(jù)地理位置和養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖習(xí)慣等情況，每個縣（市、區(qū)）隨機(jī)選取不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)，分別采用“333法”“332法”“321法”進(jìn)行免疫（免疫劑量均為1 mL/頭份）。

血清樣品來源于每年春秋兩季集中強(qiáng)制免疫后，對轄區(qū)所有12個縣（市、區(qū)）進(jìn)行驗收時隨機(jī)采集的樣品。分別采集應(yīng)用“333法”“332法”“321法”免疫的血清2 799、5 180、4 114份。組織樣品（心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)等）來源于百色市12個縣（市、區(qū)）異常死亡豬。分別采集應(yīng)用“333法”“332法”“321法”免疫程序的組織樣品383、1 167、595份。血清、組織樣品置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　血清抗體檢測

血清抗體檢測均按照相應(yīng)檢測試劑盒說明書進(jìn)行。FMD O型病毒抗體判斷標(biāo)準(zhǔn)：對照臨界值，抗體效價＜1:64時判為陰性，1:64時判為可疑，≥1:128時判為陽性。CSF病毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：PC＜40%時判為陰性，≥40 %時判為陽性。HPPRRS病毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：IRPC≤20時判為陰性，＞20時判為陽性。

1.5　組織樣品病原檢測

組織樣品的病原檢測均按照相應(yīng)檢測試劑盒說明書進(jìn)行。被檢樣品出現(xiàn)131 bp擴(kuò)增帶時判為FMD陽性，否則為陰性；被檢樣品出現(xiàn)235 bp擴(kuò)增帶時判為CSF陽性，否則為陰性；被檢樣品出現(xiàn)278 bp擴(kuò)增帶時判為HP-PRRS陽性，否則為陰性。

1.6　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

收集百色市12個縣（市、區(qū)）的生豬免疫數(shù)、發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)（包括病死數(shù)、發(fā)病淘汰數(shù)）、免疫副反應(yīng)數(shù)。利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用單因素方差分析法，對各種數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。當(dāng)P＜0.05時，判為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1　免疫密度

百色市各縣（市、區(qū)）135個鄉(xiāng)鎮(zhèn)2014—2016年應(yīng)用“333法”的FMD、CSF、HP-PRRS平均免疫密度分別為97.20%、95.27%、83.89%，應(yīng)用“332法”的平均免疫密度分別為95.28%、95.28%、90.92%，應(yīng)用“321法”的平均免疫密度均為96.24 %。與“333法”相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS免疫密度均顯著提高（P＜0.05）、FMD和CSF的免疫密度則差異不顯著（P＞0.05）；與“332法”免疫程序相比，“321法”的HP-PRRS免疫密度顯著提高（P＜0.05），F(xiàn)MD和CSF免疫密度稍有提高，但差異不顯著（P＞0.05），具體結(jié)果見表1。

表1　FMD、CSF、HP-PRRS疫苗免疫密度 單位：%

2.2　抗體檢測

對百色市各縣（市、區(qū)）春秋集中強(qiáng)制免疫質(zhì)量驗收時所采集的血清，應(yīng)用ELISA方法進(jìn)行抗體檢測。結(jié)果顯示：應(yīng)用“333法”的FMD、CSF和HP-PRRS抗體陽性率分別為90.10%、89.10%、86.17%；應(yīng)用“332法”的分別為94.25%、90.62%、90.58%；應(yīng)用“321法”的分別為94.46%、91.66%、91.27%。與“333法”相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS抗體陽性率均顯著提高（P＜0.05），F(xiàn)MD和CSF抗體陽性率有所提高，但差異不顯著（P＞0.05），具體結(jié)果見表2。

表2　FMDV、CSFV和HP-PRRSV抗體檢測結(jié)果 單位：%

2.3　病原檢測

應(yīng)用RT-PCR方法，對從百色市各縣（市、區(qū)）采集的病死豬組織樣品進(jìn)行病原檢測。結(jié)果顯示：3種不同免疫程序的FMD病原檢測均為陰性；與“333法”相比，“332法”和“321法”的CSF病原陽性率均有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），而HP-PRRS陽性率則顯著降低（P＜0.05）；“321法”與“332法”相比，CSF、HPPRRS病原陽性率有所下降，但差異不顯著（表3）。

表3　FMD、CSF和HP-PRRS病原檢測結(jié)果　單位：%

2.4　生豬發(fā)病率、死亡率和免疫副反應(yīng)率

經(jīng)統(tǒng)計百色市各縣（市、區(qū)）數(shù)據(jù)，與“333法”相比，應(yīng)用“332法”和“321法”的生豬發(fā)病率、死亡率均顯著降低（P＜0.05），而免疫副反應(yīng)率稍有增加，但差異不顯著（P＞0.05）；“321法”與“332法”相比，發(fā)病率、死亡率顯著下降（P＜0.05），而免疫副反應(yīng)率有所增加，但差異不顯著（P＞0.05）（表4）。

表4　生豬的發(fā)病率、死亡率和免疫副反應(yīng)率　單位：%

2.5　綜合評價

綜合分析各項考核指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與“333法”免疫程序相比，“332法”和“321法”的HP-PRRS免疫密度及其抗體陽性率顯著提高，HP-PRRS病原陽性率、生豬發(fā)病率、死亡率顯著下降；與“332法”相比，“321法”的HP-PRRS免疫密度顯著提高，病原陽性率以及生豬發(fā)病率、死亡率顯著下降（表5）。結(jié)果表明，3種免疫程序?qū)MD和CSF的免疫效果差異不大，而對HP-PRRS的免疫效果則顯著提高，總體而言，“332法”和“321法”均優(yōu)于“333法”，而“321法”又優(yōu)于“332法”。

3　討論

許多學(xué)者為簡化免疫程序，減少免疫次數(shù)，提高免疫效果，針對FMD、CSF、HP-PRRS疫苗開展了大量免疫試驗。張長龍等[2]采用3種疫苗同時分點免疫，發(fā)現(xiàn)3種疫苗間相互干擾較大，CSF抗體產(chǎn)生時間推遲；而先接種CSF疫苗，7 d后接種FMD和HP-PRRS疫苗，后兩者具有協(xié)同促進(jìn)作用。竇鵬勛等[3]報道，CSF、FMD、HPPRRS疫苗同時免疫可取得理想的免疫效果，F(xiàn)MD與HP-PRRS疫苗同時免疫具有協(xié)同作用，CSF和HP-PRRS疫苗同時免疫會相互影響。馬睿麟等[4]報道，CSF和HP-PRRS疫苗組合免疫，7 d后免疫FMD疫苗，發(fā)現(xiàn)FMD抗體較低；先免疫CSF疫苗，7 d后免疫FMD和HP-PRRS疫苗，CSF抗體受到干擾；FMD、CSF和PRRS 3種疫苗同時分點免疫或單獨免疫，免疫效果一致。任宇斕等[5]用FMD、CSF、HP-PRRS疫苗同時分點注射以及3種疫苗間隔7 d免疫注射，均取得了理想的免疫效果。盧景等[6]報道，F(xiàn)MD、CSF和HP-PRRS 3種疫苗同時分點免疫的抗體水平都低于單獨免疫；FMD和HP-PRRS疫苗或CSF和HP-PRRS疫苗同時分點免疫，均會相互干擾，但對7 d后免疫的CSF疫苗或FMD疫苗沒有影響；FMD和CSF疫苗同時分點免疫，7 d后再免疫HP-PRRS疫苗，產(chǎn)生的抗體效價與3種疫苗單獨免疫基本一致。陳文武等[7]報道，先免疫HP-PRRS疫苗，7 d后同時分點注射FMD和CSF疫苗，或者CSF、FMD、HP-PRRS 3種疫苗同時分點免疫注射，均會獲得較好的免疫效果；CSF和FMD同時免疫具有協(xié)同作用，CSF和HP-PRRS或FMD和HP-PRRS同時免疫會相互影響。以上報道與本研究結(jié)果并不完全一致。這可能與不同地域的氣候條件，飼養(yǎng)管理，豬的品種、年齡、健康狀況，疫苗種類，免疫程序，豬群基礎(chǔ)免疫，母源抗體水平等多種因素有關(guān)。

表5　“332法”“321法”與“333法”免疫程序各項考核指標(biāo)比較

本研究選取的百色市地處廣西西部，與越南毗鄰，處于丘陵地帶；12個縣市的氣候條件相似，養(yǎng)殖習(xí)慣、養(yǎng)殖特點、豬群品種、飼養(yǎng)管理水平也基本相同。為避免疫苗種類對不同免疫程序免疫效果影響，百色市每年所使用的疫苗均為同一廠家疫苗。但在生產(chǎn)實踐中，難以完全控制其他因素。因此，本研究在采集血清和病料樣本時，盡可能擴(kuò)大采樣的地域范圍、時間分布，增加采樣數(shù)量，以降低各種因素對免疫效果的影響。本研究結(jié)果顯示，3種免疫程序中，F(xiàn)MD和CSF的免疫效果沒有顯著差異，而HP-PRRS的免疫效果則有顯著差異。究其原因，是因為提高了HP-PRRS免疫密度，減少了應(yīng)急因素。廣西邊境地區(qū)原來應(yīng)用的是“333法”，需要抓3次豬，進(jìn)行3次免疫。畜主因擔(dān)心多次抓豬會引起應(yīng)激反應(yīng)、免疫副反應(yīng)等而影響生產(chǎn)性能，出現(xiàn)抵觸甚至拒絕后面的疫苗免疫，加上部分基層防疫人員責(zé)任心不強(qiáng)，導(dǎo)致免疫存在空白點，影響了免疫密度。本研究示范應(yīng)用的“332法”和“321法”免疫程序，減少了抓豬和免疫注射次數(shù)，養(yǎng)殖戶樂于接受和配合，因而提高了免疫密度。HP-PRRS免疫密度的提高，有效減少了HP-PRRS的臨床發(fā)病率和死亡率。本研究顯示，即使經(jīng)過疫苗免疫，仍可在病死豬組織中檢測到CSF和HP-PRRSV，說明免疫豬群中仍有CSF和HP-PRRS病原的存在和循環(huán)，因此必須對此高度重視，尤其是HP-PRRSV野毒株的感染[11-12]。

4　結(jié)論

本研究顯示，對于FMD和CSF而言，“333法”“332法”和“321法”免疫程序間的免疫密度、抗體陽性率、病原陽性率差異不顯著，即3種免疫程序的免疫效果相當(dāng)；對HP-PRRS而言，這3種免疫程序間的免疫密度、抗體陽性率、病原陽性率、生豬發(fā)病率和死亡率差異顯著，“321法”的免疫效果最好。其原因主要是由于HP-PRRS免疫密度的提高，以及總免疫次數(shù)的減少，降低了生豬發(fā)病率、死亡率，減少了應(yīng)激刺激。臨床上，可以根據(jù)實際情況優(yōu)先選擇應(yīng)用“321法”，其次可選擇應(yīng)用“332法”免疫程序。

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